この方法は、インビトロの肺癌細胞における2つのマイクロRNAの活性を同定するために必要なラボ技術を理解し、実行するのに役立ちます。肺癌は、世界中の癌関連死の主な原因です。ここでは、基本的なラボ手法から、遺伝子発現解析や抗体タンパク質マイクロRNAなどのより複雑なプロトコルに至るまでの手法を紹介し、マイクロRNAの作用の効果を特定するために特に使用します。
以下の方法は、2つのマイクロRNA143およびmicroRNA 506が肺癌細胞の細胞周期を調節する際の影響に関する重要な質問に答える助けとなるでしょう。細胞トランスフェクション、RNA抽出、定量的リアルタイムPCR、マイクロRNA解析など、さまざまなラボ手法を紹介します。私たちのプレゼンテーションがこれらの分析を正常に完了することに貢献することを願っています。
まず、培養細胞をRNAおよびタンパク質抽出に十分な適切なフラスコに座り、qPCRまたはマイクロアレイ解析を用いて遺伝子発現を行う。その後、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを補ったメディアで一晩インキュベートします。翌日、マイクロRNA143とマイクロRNA506をそれぞれ100ナノモルの濃度で培地中に希釈してトランスフェクション用のマイクロRNAサンプルを調製する。
インキュベーターからフラスコを取り出し、培地を取り出します。1倍のPBSで洗います。未処理のコントロールには、不完全なメディアのみがセルに含まれます。
細胞をインキュベーターで6時間トランスフェクション培地でインキュベートします。6時間後、メディアを取り出し、新鮮で完全な培地を4ミリリットルに交換します。トリプシン法により24時間後、48時間後に細胞を収穫する。
次に、各チューブに1x PBSで2回洗浄し、上清を除去します。後でRNA抽出を行うために、マイナス80度で細胞を凍結します。RNA抽出は、メーカーの指示に従って、RNAキットを使用して行った。
まず、マイナス80度からチューブを取り外し、解凍することができます。細胞膜を壊すために300マイクロリットルのリシスバッファーとピペットを上下に加えます。100%超純エタノールの等しい量を加えます。
その後、よく混ぜ、区切られた列に配置します。遠心分離機を使用し、フロースルーを取り除く。400マイクロリットルの洗浄とバッファーと遠心分離機を加え、バッファーを取り除きます。
各サンプルに75マイクロリットルのVNA消化バッファーを含むDNAse 1を5マイクロリットル加え、15分間インキュベートします。その後、400マイクロリットルのRNA調製バッファーでサンプルを洗浄します。次に、RNA洗浄バッファーで2回洗浄します。
次に、ヌクレアーゼを含まない水をカラム、遠心分離機に加え、RNAを回収します。RNA濃度を測定します。この段階では、RNAシーケンシング用に2マイクログラムのRNAサンプルを送ることができます。
サーモサイクラーを使用して、テキストセクションに記載されているプロトコルに従ってcDNAを準備します。DNAse RNAseフリー水を用いて、10マイクロモルの濃度に前進および逆プライマー溶液を調製します。サンプル数に応じて検出される各遺伝子のマスターミックスを準備します。
各cDNAサンプルについて、反応量は、テキストに記載された表に従って行います。各サンプルをそれぞれのウェルに配置します。qPCR の場合、サンプルを追跡するために、96 ウェルプレートレイアウトを持つ Excel ドキュメントを準備することをお勧めします。
各サンプルおよび分析された遺伝子について、三重化または少なくとも重複でそれらの反応を行う。透明で光学的に透明なプラスチックシーラーでプラスチックプレートを密封します。これは偽の信号を生成することができますので、指で薄い、プラスチック層に触れないようにしてください。
素早くプレートを回転させ、すべての試薬をウェルの底に混ぜます。次に、定量的なリアルタイム PCR マシンを使用してサンプルプレートを実行します。qPCRマシンによって生成されたCT値を取得し、相対遺伝子発現について分析します。
このビデオの前のセクションで説明したように、セルをトランスフェクトします。トリプシン化用の各サンプルから細胞を15ミリリットルの無菌チューブで収穫する。次に、細胞を1xPBSで2回洗浄し、751Gで5分間遠心分離し、次いで上清を取り除いた。
ピペットを通して200マイクロリットルの氷冷1x PBSを加えることによってパレットを再中断して壊します。70%の氷冷エタノールの2ミリリットルを加え、チューブに落とし、チューブを穏やかに渦して細胞を固定します。チューブを室温で30分間インキュベートし、摂氏4度に1時間入れます。
4°Cと遠心分離機からチューブを取り外します。2mlの氷冷PBSと渦を加え、遠心分離によって上清を取り除きます。ヨウ化プロピジウムとリボヌクレアーゼAを含む1x PBSの500マイクロリットルを、それぞれ1ミリリットル当たり50と200マイクログラムの濃度で加え、各サンプルに、室温で30分間インキュベートする。
サンプルを適切なチューブに移し、光から保護し、フローサイトメーターで実行します。本実験は、マイクロRNA処理によって変化したタンパク質の発現の全ての細胞周期経路を同定するものである。トランスフェクションセクションに記載されている手順に従ってタンパク質サンプルを収集し、BCAアッセイで定量します。
実験の1時間前にマイナス4度からスライドを取り除き、室温に持ち込み、水分を取り除きます。70マイクログラムのタンパク質サンプルを採取し、メーカーの指示に従ってサンプルスライドを準備します。ここでは、超純粋な脱イオン水でスライドの適切な洗浄は、これはスライドの背景を減らすのに役立つため、別の重要なステップです。
さらに、この実験では、最終段階までサンプルスライドを乾燥しないことが非常に重要です。最後に、マイクロアレイマシンを使用してスライドをスキャンし、データを分析します。マイクロRNA処理サンプルのqPCR分析は、CDK1、CDK4およびCDK6の遺伝子発現を決定するために行われた。
これらの遺伝子は、正常細胞および癌細胞の細胞周期を調節し、腫瘍進行を阻害する手段として標的とされてきた。このデータは、microRNA 143および506による治療によるこれらの遺伝子のダウンレギュレータ効果を実証した。フローサイトメトリーからの細胞周期分布データは、G0およびG1相における集団増加を示し、マイクロRNA143および506の組合せ処理の効果によるS相の集団減少を示した。
細胞周期特異的マイクロアレイ解析では、約60遺伝子のタンパク質発現変化を検出した。表されたヒートマップは、CDK2、ヘレン1および3、RE2F1などの細胞周期および増殖の進行に必要な複数の遺伝子のタンパク質レベルでのダウンレギュレーションを示した。対照的に、増殖した阻害効果によって一般的に認識されるタンパク質は、アップレギュレートされた。
結果は半定量的でさらなる分析が必要ですが、マイクロアレイ解析では経路の活性の概要が簡単に得られます。このビデオを見た後、細胞内のマイクロRNA活性の同定に役立つ基本的な、複雑なラボ実験を行うことができると信じています。
