我々のプロトコルは、生物学的シナプスの組成、構造、および輸送特性を密接に模倣し、調整可能な記憶抵抗を示すペプチドドープバイオメンブレンを組み立て、電気的に特徴付ける方法を記述する。この技術は、生物学的シナプスとイオンチャネルに関連する時間スケールおよび励起レベルで、操作システムにおける活動依存性、記憶抵抗性および短期可塑性を評価するユーザーを支援します。この技術は、電圧活性化イオンチャネルを含むバイオミメティック膜を特徴付けるためのフレームワークを提供し、ニューロン内のものを含む様々な細胞輸送プロセスの特性評価に適用可能である。
新しい研究者への提案は、まずリポソーム溶液を調製し、ワイヤタイプ電極上の液滴界面二重層を組み立てることに熟練することです。電極上の液滴分配および位置決めのためのプロセスを直接見ることは二重層形成のためのこの技術を簡単にし、それがすぐにすべてにアクセスできるようにします。この手順を実証することは、私の研究室のポスドクであるジョセフ・ナジェム博士です。
まず、アラメチシンペプチド粉末をエタノールに溶解して1ミリリットル当たり2.5ミリグラムの最終濃度に溶解することにより、マイクロ遠心分離管にアラメチシンストック溶液を調製する。チューブを短く渦を混ぜてよく混ぜ、ストック溶液をマイナス20°Cの冷凍庫に保管します。1.5ミリリットルのセーフロックチューブで、溶液Aの99マイクロリットルにアラメチシンストック溶液の1マイクロリットルを加え、リポソーム懸濁液中の13マイクロモルの最終的なアラムメチシン濃度を達成する。
よく混ぜる渦。得られたペプチドリポソーム溶液は、溶液Aの溶液Aを10マイクロモルの最終的なアラメチシン濃度を達成し、次いでボルテックスを良好に混合する溶液である。得られたソリューションを C.Store として参照してください摂氏 4 度でソリューション B と C を格納します。
逆顕微鏡のステージ上に厚さ25倍75ミリメートルのガラス側に1ミリメートルを置きます。ガラススライドの中央にヘキサデカンオイルを数滴塗布し、オイルリザーバーをグラススライドのオイルに直接置きます。完全に六角油でオイル貯蔵所を充填します。
貯水池が対物レンズの上に配置されていることを確認します。次に、電極ホルダーをマイクロマニピュレーターに取り付けられた電流アンプのヘッドステージに差し込みます。マイクロマニピュレーターは電極の長さおよび電気的な騒音を最小にする。
次に、ガラスマイクロピペットホルダーに2本目の銀塩化銀-塩化線を付けて別のマイクロマニピュレーターに取り付けます。マイクロマニピュレータを使用して、銀塩化銀-塩化銀線のアガロースコーティングされた先端が同様の垂直平面で油貯蔵所に完全に沈むような電極を配置します。2つの電極を合わせ、数ミリメートルで分離します。
脂質二重層を形成するには、電極を油相に垂直に移動させる。マイクロピペットを使用して、各ワイヤに200ナノリットルの脂質溶液Aを堆積させます。水油界面で自発的な脂質単層アセンブリが発生するように、3~5分待ちます。
周囲の油が十分に密度が低い場合、液滴がたるむ可能性があります。その後、両方の電極の端が油貯留層の底にほとんど触れるまで再沈水するように電極を下げる。次いで二重層を形成し、電極を水平に動かして液滴を接触させる。
挟まれた、ヒステリティック、電流電圧の関係を得るために、関数発生器を使用して、溶液Aの液滴で組み立てられたアラムメチシンフリーの脂質膜に三角または正弦電圧波形を適用します。界面脂質二重層の大きさを記録するには、コンピュータ上で脂質膜の直径を測定するか、10ヘルツから生じるピークからピークまでの電流振幅を記録し、10ミリボルト三角波を記録して膜の面積を算出する。油相からワイヤーを取り出し、アラムエチシンを含まない液滴を取り除きます。
溶液Cを用いて新しい水滴を添加し、脂質二重層を形成する。四方波電流振幅に基づいて、マイクロマニピュレータを使用して液滴間の接触を調整し、二重層が先に形成されたものと同様の面積を有するようにする。その後、10ヘルツと10ミリボルトの電圧波形を適用し、以前のように誘導電流応答を記録します。
カスタムプログラミングソフトウェアとアナログ電圧源を使用してパルス実験を行う場合は、時間とオフの時間に特定の高い、低振幅の電圧パルスを生成します。適用されたパルスに応答して電流を記録します。電流対電圧のプロットは、アラムメチシンフリー脂質二重層への電圧バイアスの適用時の非ゼロ電流応答を示す。
0.017ヘルツ(インピーダンスが膜抵抗によって支配される周波数)を追加します。低オーミック電流応答は、高絶縁膜に対して示されている。アラメチシンペプチドを含む2つの液滴の間に形成された脂質二重層のプロットは、100ミリボルトの挿入閾値よりも高い電圧で指数関数的に電流を増加することを示す。
高電圧では、脂質二重層の表面に存在するアラメチシンペプチドが膜に挿入し、凝集して導電性細孔を形成する。両極性における対称電流応答は、膜の反対側からのペプチドの別々の集団の挿入および凝集によるものです。容量性電流は、メムリシティブ、ピンチヒステリシス電流電圧応答のみを得るために、全電流から差し引く必要があります。
生体分子メムリスタは、各オフ時間の間に断続的に絶縁状態を回復するにもかかわらず、時間の間にコンダクタンスの増加と後続の電圧パルスに応答します。現在の刺激と以前の刺激の両方が現在の増加に寄与する。両方の液滴の凝集した単層は、二重層を形成するためにそれらを一緒に持って来る前に形成する必要があります。
液滴が早く集まると合体し、二重層は形成されません。現在、ORNLの高性能スーパーコンピュータのネットワーク同化最適化によって支えられる膜ベースのシナプスで接続された固体ニューロンからなる、微小流体ベースニューラルネットワークを設計し、製造しています。これらのメムリスタは、生物学的シナプスの組成、構造、切り替え機構、イオン輸送を持つ最初のものです。
したがって、彼らは脳のようなコンピューティングとメモリを追加する生体分子ベースを提供します。
