この作品は、国立衛生研究所（R01 GM092993）からSHOの補助金によって支えられて、全米科学財団（NSFキャリア賞、DBI 0964216）、米海軍研究局（ONR）若手研究プログラムとバイオテクノロジーのためのミネソタパートナーシップ賞医療ゲノミクス。デバイス製造は、国家ナノテクノロジー基盤ネットワークを介してNSFの支援を受けてミネソタ大学のナノファブリケーションセンター（NFC）、で行った。この作品はまた、国立衛生研究所（NS048357、R 21 NS073684）、国立多発性硬化症協会（CA1060A11）、アップルバウム、ヒルトン、ピーターソンとフォード財団やMCNEILUSファミリーからMRに補助金によって支えられている。著者らは、走査型電子顕微鏡の支援のためのイラストやShailabhクマーの支援についてはHyungsoonイムに感謝したいと思います。

マイクロウェルアレイ基板の1。微細加工<ol><li>熱成長酸化物を100nmで4インチシリコンウエハで始まる。 </li><li> 30秒間、4,000 rpmで、ウェハ上に、SPR-955 0.7フォトレジストをスピン。 </li><li> 90秒間115℃のホットプレート上で焼く。 </li><li>フォトレジストを露光。 <ol><li>アレイが2ミリメートル×2ミリメートルの領域をカバーして3ミクロン周期の六角形のアレイ状に配置された1ミクロンの穴が作成されたマスクを使用してください。 </li><li> 6mmのステップサイズは200ミリジュール/ cm 2の露光を用いて、i線ステッパーでウエハを露光する。 </li></ol></li><li> 90秒間115℃のホットプレート上で焼く。 </li><li> 90秒の総開発時間のために、ウェーハ上のCD-26の2水たまりを堆積させるためにスピンデベロッパを使用して開発しています。 </li><li>超純DI水で十分に洗い流し、N 2で乾燥させます。 </li><li> Arを50 SCCM、CF 4の25 SCCM、及びCHF 3 FLOの50 SCCMで6分間反応性イオンエッチング装置、酸化物をエッチングする75トルの圧力で翼。 </li><li> C 4 F 8、SF 6、Arを40 SCCM、および14トルの圧力で流れるO 2の10 SCCMの27 SCCMの63 SCCMで2分間のICPディープトレンチ反応性イオンエッチング装置でシリコンをエッチング。 </li><li>レジストを除去するためにアセトン、メタノール、およびイソプロパノールですすぐ。 </li><li> H 2の浴の代わりSO 4：表面を洗浄するための10分間のH 2 O 2 1:1である。 </li><li>超純DI水で十分に洗い流し、N 2で乾燥させます。 </li><li> 250℃での原子層堆積によって堆積物の Al 2 O 3の1080オングストローム</li></ol> 2ポリの製造（ジメチルシロキサン）スキージ<ol><li>可能な場合は、クリーンルームで働いています。そうでなければ可能な最もクリーンな環境で動作します。 </li><li> ≥13ミリメートルの両側にプラスチック製のペトリ皿（またはその他のクリーン使い捨て容器）を取得します。 </li><li>その皿の中で、50グラムのPDMSのBASが続き、5グラムのPDMS硬化剤を注ぐEエージェント（またはほとんどペトリ皿を記入します1:10の比で何か）。使い捨てのプラスチックピペットや棒でよく混ぜる。 </li><li>気泡が混合物（約30分）から出てくるまで、真空を適用し、真空ラインでチャンバ内で混合さPDMSを配置することにより気泡を除去。 </li><li>ペトリ皿に既にされていない場合、気泡の生成を回避し、ペトリ皿中のPDMSを注ぐ。 </li><li> 50℃（短い時間のために高い熱も動作します）&gt;ホットプレート上で一晩硬化する。 </li><li>新しい/クリーンかみそりの刃で、慎重に、可能な限りクリーンな上面を保ち、矩形片約2.5×2.5センチカット。清潔なピンセットを用いてはがします。 （これはスキージ工程で使用されるエッジになります）できるだけ鋭い上端を作るために、一つの動きにカミソリの刃を押し下げて、1辺（1.5センチダウン）を切り落とす。 </li><li>次いで、アセトン、メタノール、イソプロピルアルコール、超純DI水できれいにし、クリーンな窒素ガスでブロー乾燥した。きれいなペトリ皿に保管してください。 </li></ol>小胞の3。準備<ol><li> 25 mg / mlの卵ホスファチジルコリン（PC）の脂質ストック溶液を収集し、1 mg / mlの1,2 -ジパルミトイル-sn-グリセロ-3 -ホスホエタノールアミン-N - （リサミンローダミンBスルホニル）アンモニウム塩（Rho-イソDPPE）をクロロホルムクロロホルム/メタノール中のモノシアロ​​ガングリオシドGM1の0.5 mg / mlのストック溶液（2:1 v / v）であった。 </li><li>小さなガラスバイアル中の25 mg / mlのPCの18.9μlの、0.5ミリグラムの39.6μlの/ mlのGM1との7.9μLを添加することによって97モル％のPCに、2モル％GM1及び1モル％のRho-DPPE結果混合物を作る1ミリグラム/ガラスシリンジを使用してミリリットルのRho-DPPE。 </li><li>注：Nairさんら 25の補足材料は、任意の所望の組成のベシクルを作成するために必要な脂質の量を算出するための優れたカスタマイズ可能なExcelスプレッドシートが含まれています。 </li><li>真空デシケーター中でバイアルを置き、6時間真空下でバイアルを残すことによって溶媒を除去する。 </li><li> 0.1の水溶液を作るのNaCl。乾燥した脂質フィルムを含むバイアルに、0.1M NaCl溶液0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>水性の脂質混合物を一晩休ませることができます。 </li><li>室温でのバスソニケーターで20分間超音波処理して、小胞体分散液を作成するために簡単に説明すると渦ミックス。 </li><li> 100 nmの細孔サイズを有するポリカーボネート膜を介して小胞懸濁液を押し出す。フィルタ17Xによってベシクル懸濁液を渡します。 </li><li> 4℃でガラスバイアル中で押し出された小胞を保存</li></ol>球面支持された脂質二重層から4。の形成<ol><li> 700 nmの直径のSiO 2ビーズを収集します。ビーズは、1.4×10 11ビーズ/ mlのストック濃度で蒸留水に供給される。 </li><li> 1.5mlのエッペンドルフチューブ中の0.1 M NaClを893μlのビーズストック溶液の107μLを添加することによって1.5×10 10個のビーズ/ mlの濃度の1mlのビーズ懸濁液を調製する。 </li><li>それがよくマイルであることを保証するために、サスペンションをボルテックスXED。 </li><li>遠心分離器20分間1700×gで懸濁液を次いで、上清を捨てる。 0.1 MのNaCl 1ml中にビーズを再懸濁する。徹底的にビーズを洗浄するためにさらに2回、この手順を繰り返します。 </li><li> SSLBsを形成するために、1.5mlのエッペンドルフチューブに1 mg / mlの小胞懸濁液200μlをSiO 2ビーズ懸濁液25μlを加える。ボルテックス混合し、室温で1時間放置してみましょう。この段階でSSLB濃度が1.7×10 9 SSLBs / mlである必要があります。 </li><li> SSLBsをペレット20分間1700×gで遠心します。ペレットは、ビーズ上のRho-DPPEとの小胞の破裂をピンク色に表示されます。 </li><li> 225μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH値= 7.4での上清と再懸濁を捨てる。繰り返しますSSLB懸濁液から任意の未破裂小胞を除去するために4.6から4.7をさらに2回繰り返します。 </li></ol> 5。総会SSLBの配列<ol><li> 4-6 MICとの長方形片に生じたマイクロウェルアレイのクリーブウエハ一枚あたりのローウェル·アレイ。 </li><li>渦がSSLBサスペンションを混ぜ、その後、各マイクロウェルアレイ上SSLB懸濁液10μlを置く。残りのないよう、1時間SSLBsを表面に安定するようにします。 </li><li>優しく浅い皿に用意し、PBS浴に沈めた後、洗浄瓶からPBSでマイクロウェルアレイチップを洗う。 </li><li>水没しながら、ゆっくりとマイクロウェルアレイチップのPDMスキージフラッシュを置き、ゆっくりとマイクロウェル中に固定化されていないSSLBsを削除するために、表面5Xに沿ってスライドさせます。 </li><li>余分SSLBsを削除するために、PBS浴にグリップピンセットでマイクロウェルアレイチップ、ゆっくり振る。 </li><li>すぐにスキージ浴からチップを取り外し、さらに使用するまで新しいPBS浴に配置します。チップの上面がSSLBsを保存する濡れたままにしてください。 </li></ol>注：上述の組立方法は、天然の膜粒子のアレイを作成するために使用できる、ミエリンマウス脳から単離された粒子、またはフォーのようなSiO 2のビーズがサポートなしでspholipid小胞。この作業は、ウィッテンら 21及び代表的な結果を以下に示すに詳細に記載されている。 6。コレラ毒素結合アッセイ<ol><li> PBS中のウシ血清アルブミン（BSA）の2 mg / mlの溶液を調製する。 </li><li> 2 mg / mlのBSAを含むPBS中でアレクサ488コンジュゲートコレラ毒素Bサブユニットの所望の濃度の溶液を調製する。 </li><li> PBS浴からSSLBアレイチップを取り外し、拭いて、実験室を使用して、PBS溶液のほとんどを吸い取る。 SSLBアレイが水和し維持するために、チップ上だけで十分なのPBSを残す。 </li><li>非特異的結合を防ぐために、SSLBアレイチップに2 mg / mlのBSA溶液を200μlを加える。湿潤箱中で1時間休ませ。 </li><li>マイクロピペットで、SSLBアレイチップの上部から溶液200μlを削除します。 </li><li> SSLBアレイチップにコレラ毒素溶液200μlを加え、湿潤箱中で1時間の休憩をしましょう​​。 </li><li>優しく未結合のコレラ毒素を除去するための洗浄瓶からPBSでSSLBアレイチップを洗う。 </li><li>拭いて研究室を使用して過剰のPBSを吸い取る。 24ミリメートル×40ミリメートルのカバースリップでカバーチップを画像化する前に。 </li><li>関心対象のフルオロフォアのための適切なフィルターセットを用いて正立顕微鏡の画像アレイ。 </li><li> ImageJソフトウェアの自動化された粒子解析関数を使用して、アレイ内の個々のSSLBsの蛍光強度を分析する。 </li><li>指定された配列で発見SSLBsの強度をまとめたヒストグラムに個別SSLBsからの平均蛍光強度をコンパイルします。 </li></ol>

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H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Curved+Membranes+Recruit+Amphipathic+Helices+and+Protein+Anchoring+Motifs.">How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+G-Protein-Coupled+Receptors+in+Cell-Derived+Plasma+Membranes+Supported+on+Porous+Beads.">Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。

本研究では、支持された脂質二分子層で被覆された単分散SiO 2のビーズは、脂質二重層または基板表面にリガンドを標的化するための必要なしにマイクロウェルアレイに配列することができ、アレイは、毒素-脂質相互作用を特徴づけるために使用することができることを示している。我々はCTx/GM1結合に計算された解離定数は冬らの以前の報告。、脂質でコーティングしたビー?...

脂質二重膜は、本質的に必須の構造である。携帯形質膜や細胞小器官の膜は、生活のために必要である分子の数を組み込んだ脂質二重層で構成されています。多くの生命維持プロセスは、細胞の表面に発生するか、脂質二重膜と結合する分子によって媒介される。実際には、多くの医薬品対象プロセスまたは分子は、1,2または膜上に見出される。これは、分析的に、膜表面で起こる化学反応または非共有結合事象のようなプロセスを調査することが必要である。天然の膜は、単離することが困難および/またはセンサとのインタフェースとすることができるので、多くの研究者が分析研究を実施するために簡略化されたモデル膜を用いる。モデル膜システムの数は、数十ナノスケール寸法を有するリポソーム3,4に直径数百ミクロンにすることができる巨大な小胞に至るまで、文献に記載されている。 ALTERNatively、固体支持体上に堆積された平面脂質二重層は、 すなわち 、異なる表面の数に形成することができ、広く、生物物理学的、生化学的、および分析アプリケーション5で使用されているが、脂質二重層（のSLB）を支持した。電気的または光学材料でのSLBとを連結すると、さまざまな分析技術を利用して膜生化学および生物物理学の研究を可能にします。蛍光顕微鏡6、7電気化学、光学分光8、走査型プローブ顕微鏡法9、表面プラズモン共鳴10、および質量分析11は、すべてのSLBの構造と特性を研究するために使用されてきた。 SLBアレイは多重アッセイ12,13のためのセンサーの設計に追加の汎用性を提供します。他のアプリケーションは、免疫細胞14の間に形成される接合を模倣するために、SLBアレイを使用しています。 SLBアレイの製造方法は、microfluから変化しているIDICは、隣接のSLBパッチ間の物理的な障壁を用いるものと15に近づく。16他のグループが印刷方法17を使用していた、光化学パターニング18と、様々なナノエンジニアリングは、SLBアレイを作成するために19に近づく 。 本論文では、添付のビデオでは、マイクロウェル20の順序付き配列にSLBでコーティングされたSiO 2ビーズを堆積させることにより、SLBアレイを形成する方法を示しています。私たちは、球状の支持された脂質二重層（SSLBs）などのSLBでコーティングされたSiO 2ビーズを参照してください。この技術は、我々はまた、例の結果を示し、そこから自然発生源21に由来リン脂質小胞と生体膜の配列を作成した初期の研究の延長である。生体粒子または小胞を配列するための他の方法は、小胞の表面上に含まれる相補的なリガンドと会合する表面上の特定の標的化リガンドのパターンに頼ってきた。例としては、ビオチンを含んでアビジン会合22,23及びDNAハイブリダイゼーションスキーム24。我々のアプローチは、必要のない標的化または認識部分を有するマイクロウェルアレイを必要とします。 SSLBsのサイズは、低多分散性を持ったSiO 2ビーズ支持体の直径によって定義されます。 SSLBの直径よりも大きいだけに、マイクロウェルの直径を調整することによって、単一SSLBは、各マイクロウェルに落ち着く。ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）スキージはその後、表面からマイクロウェル中に固定化されていないすべてのSSLBsが削除されます。得られたSSLBマイクロウェルアレイは、3μmの中心間間隔および六角形の周期性を有する高密度（〜10 5 SSLBs個/ mm 2）を有する。直列異なる脂質組成物でSSLBsを堆積させることによって、それがランダムに配置SSLBsを有する多成分アレイを作成することができる。 SSLBアレイの感知能力を実証するために、我々はSSLBsに組み込まガングリオシド（GM1）でコレラ毒素（CTX）の相互作用を用いる。ととも​​に天然の膜粒子は、我々は2つ​​の異なる種類の細胞からの膜材料を含む多成分アレイにおいて、細胞特異的脂質を検出することができた。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">4-inch silicon wafers</td>
			<td style="width:91px;">University Wafer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">425</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">SPR955-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MICROPOSIT CD-26 developer</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">CD-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">i-line stepper</td>
			<td style="width:91px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;">2500 i3 stepper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vision 320 reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Vacuum</td>
			<td style="width:119px;">Vision 320 RIE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Deep trench reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Plasma Therm</td>
			<td style="width:119px;">SLR-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Atomic layer depostion system</td>
			<td style="width:91px;">Cambridge NanoTech</td>
			<td style="width:119px;">Savannah</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit</td>
			<td style="width:91px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">egg phosphatidylcholine</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:239px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">monosialoganglioside GM1&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">860065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Silica beads</td>
			<td style="width:91px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">SS03N/4666</td>
			<td>Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C-34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">NL1326R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">FM1-43</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Eppendorf MiniSpin centrifuge</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-401-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of biomembrane microarrays with a squeegee-based assembly method

脂質二分子膜は、細胞の原形質膜を形成し、細胞内オルガネラの境界を画定する。自然界では、これらの膜は、脂質の多くの種類の不均質混合物である膜結合タンパク質を含んでおり、糖質が飾られています。いくつかの実験では、天然のものから、膜の脂質二重層の生物物理学的又は生化学的特性を分離することが望ましい。そのような場合には、このような巨大ベシクル、リポソームまたはサポートされている脂質二重層（のSLB）などのモデルシステムの使用を求める。のSLBのアレイは、アプリケーションを検出し、細胞 - 細胞相互作用を模倣するために特に魅力的である。ここでは、SLBアレイを形成するための新たな方法を説明します。サブミクロン径のSiO 2ビーズが第1の球面のSLB（SSLBs）を形成する脂質二重層で被覆されている。次いで、ビーズを微細加工サブミクロン径のマイクロウェルのアレイに堆積される。別れるながら調製技術は、基板表面を洗浄するために「スキージ」を使用しマイクロウェルに落ち着いてきSSLBsの後ろグラム。この方法は、マイクロウェル基板のない化学修飾、またSSLB上の任意の特定の標的化リガンドを必要としません。ウェルの直径は、ビーズの直径よりもわずか大きくなるようにチューニングされているので、マイクロウェルは単一のビーズによって占有されている。残りは空のままで一般的には、井戸のより多くの75％は、占有されている。緩衝液中でSSLBアレイは、より大きな一週間の長期安定性を示す。我々は、ガングリオシドGM1とコレラ毒素の相互作用を特徴付けることによって実証する、SSLBs複数種類のシリアル堆積によって単一のアレイに配置することができ、およびアレイは、感知のために使用することができる。我々はまた、細胞源からビーズ支持体と生体膜なしのリン脂質小胞は、同じ方法で配列することができ、細胞特異的膜脂質を同定することができることを示している。

SiO 2のビーズは、リン脂質、蛍光脂質およびガングリオシドなどのような他の脂質からなる小胞の溶液と混合すると、図1aに模式的に示すように、小胞は、SSLBsを形成するためにSiO 2をビーズ表面上で破裂。 SSLBsを洗浄した後、SSLB溶液の滴をマイクロウェルアレイ上に配置し、ビーズを表面に沈降させる。 （ 図1B1）これは、 図1b2とに示?...

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Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

サポートされている脂質二重層と天然膜粒子は、細胞膜の特性を近似することができると分析種々の戦略に組み込むことが好都合システムである。ここでは、サポートされている脂質二分子膜でコーティングされたSiO 2ビーズ、リン脂質小胞または天然の膜粒子からなるマイクロアレイを調製するための方法を実証する。

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

formation-biomembrane-microarrays-with-squeegee-based-assembly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K ビュー.  University of Minnesota. サポートされている脂質二重層と天然膜粒子は、細胞膜の特性を近似することができると分析種々の戦略に組み込むことが好都合システムである。ここでは、サポートされている脂質二分子膜でコーティングされたSiO 2ビーズ、リン脂質小胞または天然の膜粒子からなるマイクロアレイを調製するための方法を実証する。 

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

シルバーシード媒介成長法によるゴールドNanostarの合成

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

生物工学

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.