Il nostro protocollo descrive come assemblare e caratterizzare elettricamente una biomembrana drogata da peptidi che imita da vicino la composizione, la struttura e le proprietà di trasporto delle sinapsi biologiche e che mostra una resistenza alla memoria tonnibile. Questa tecnica consente agli utenti di valutare la dipendente dall'attività, la resistenza alla memoria e la plasticità a breve termine nei sistemi ingegnerizzati su scale di tempo e livelli di eccitazione rilevanti per sinapsi biologiche e canali ionici. Questa tecnica fornisce una struttura per caratterizzare le membrane biomimetiche contenenti canali ionici attivati dalla tensione, rendendola applicabile alla caratterizzazione di una varietà di processi di trasporto cellulare, compresi quelli nei neuroni.
Il nostro suggerimento ai nuovi ricercatori è di diventare prima abili nel preparare soluzioni liposomiche e assemblare un bistrato di interfaccia a goccia su elettrodi di tipo filo. Vedere in prima persona il processo di erogazione e posizionamento delle goccioline sugli elettrodi semplifica questa tecnica per la formazione di due strato, rendendola immediatamente accessibile a tutti. A dimostrare questa procedura sarà il dottor Joseph Najem, un postdoc del mio laboratorio.
Per iniziare, preparare la soluzione di calcio di alametina nel tubo di microcentrifugo sciogliendo la polvere di peptidi di alametina in etanolo a una concentrazione finale di 2,5 milligrammi per millilitro. Vortice brevemente il tubo per mescolare bene e conservare la soluzione stock in un congelatore meno 20 gradi Celsius. In un tubo Safe-Lock da 1,5 millilitri, aggiungere un microlitro di soluzione di alametina a 99 microlitri della soluzione A per ottenere una concentrazione finale di alametica di 13 micromolari nella sospensione liposoma.
Vortice da mescolare bene. La soluzione liposoma peptidica risultante è la soluzione B.Mescolare 117 microlitri della soluzione A con 10 microlitri della soluzione B per ottenere una concentrazione finale di alametina di un micromolare, quindi vortice per mescolare bene. Fare riferimento alla soluzione risultante come C.Store le soluzioni B e C a quattro gradi Celsius.
Posizionare un lato di vetro spesso un millimetro 25 volte 75 millimetri sul palco di un microscopio invertito. Distribuire alcune gocce di olio di esadecano al centro dello scivolo di vetro, quindi posizionare il serbatoio dell'olio direttamente sull'olio sullo scivolo di vetro. Riempire completamente il serbatoio dell'olio con olio di esadecano.
Assicurarsi che il serbatoio sia posizionato sopra l'obiettivo. Quindi collegare il supporto dell'elettrodo allo stadio di testa di un amplificatore di corrente montato su un micromanipolatore. Il micromanipolatore riduce al minimo la lunghezza dell'elettrodo e il rumore elettrico.
Quindi, montare il supporto in micropipetta di vetro con il secondo filo di cloruro argento-argento su un altro micromanipolatore. Utilizzando i micromanipolatori, posizionare gli elettrodi in modo che le punte rivestite di agarosio dei fili di cloruro argento-argento siano completamente sommerse nel serbatoio dell'olio su un piano verticale simile. Allineare i due elettrodi e separarli di alcuni millimetri.
Per formare il bistrato lipidico, spostare gli elettrodi verticalmente nella fase dell'olio. Utilizzare la micropipetta per depositare 200 nanolitri di soluzione lipidica A su ciascuno dei fili. Attendere da tre a cinque minuti per consentire l'assemblaggio spontaneo del monostrato lipidico all'interfaccia dell'olio d'acqua.
Le goccioline potrebbero abbassarsi se l'olio circostante è sufficientemente meno denso. Successivamente, abbassare gli elettrodi per ri-immergersi fino a quando le estremità di entrambi gli elettrodi toccano a malapena il fondo del serbatoio dell'olio. Quindi, per formare il bistrato, spostare gli elettrodi orizzontalmente per portare le goccioline in contatto.
Per ottenere la relazione pizzicata, isterica, di tensione di corrente, utilizzare un generatore di funzioni per applicare una forma d'onda di tensione triangolare o sinusoidale a una membrana lipidica priva di alamethicina assemblata con goccioline della soluzione A.Registrare la risposta di corrente indotta attraverso più frequenze. Per registrare la dimensione del bistrato lipidico interfacciale, misurare il diametro della membrana lipidica su computer o registrare l'ampiezza di corrente dal picco al picco risultante dall'onda triangolare da 10 hertz, 10 millivolt per calcolare l'area della membrana. Togliere i fili dalla fase dell'olio per rimuovere le goccioline che non contengono alametina.
Aggiungere nuove goccioline acquose utilizzando la soluzione C e formare un bistrato lipidico. In base all'ampiezza della corrente d'onda quadrata, utilizzare i micromanipolatori per regolare il contatto tra goccioline, in modo che il bistrato abbia un'area simile a quella formata in precedenza. Quindi applicare una forma d'onda di tensione da 10 e 10 millivolt e registrare la risposta di corrente indotta come in precedenza.
Per condurre esperimenti di impulsi utilizzando un software di programmazione personalizzato e una sorgente di tensione analogica, generare impulsi di tensione con ampiezze specifiche alte e basse in tempo e fuori tempo. Registrare la corrente in risposta agli impulsi applicati. La trama tra corrente e tensione mostra la risposta di corrente diversa da zero all'applicazione di una distorsione di tensione a un bistrato lipidico privo di alametina.
Aggiungere 0,017 hertz, una frequenza in cui l'impedenza è dominata dalla resistenza della membrana. Una risposta a bassa corrente ohmica è mostrata per la membrana altamente isolante. La trama di un bistrato lipidico formato tra due goccioline contenenti peptidi di alametina mostra correnti esponenzialmente crescenti a tensioni superiori alla soglia di inserimento di 100 millivolt.
Ad alta tensione, i peptidi di alametina che risiedono sulla superficie del bistrato lipidico si inseriscono nella membrana e si aggregano per formare pori conduttivi. Le risposte di corrente simmetrica ad entrambe le polarità sono dovute all'inserimento e all'aggregazione di popolazioni separate di peptidi dai lati opposti della membrana. La corrente capacitiva deve essere sottratta dalla corrente totale per ottenere solo la risposta memristive, pizzicata di corrente-tensione dell'isteresi.
La risposta del memristor biomolecolare ai successivi impulsi di tensione con un aumento della conduttività durante il tempo di inneggio, nonostante il ripristino intermittente di uno stato isolante durante ogni tempo libero. Sia lo stimolo attuale che gli stimoli precedenti contribuiscono all'attuale aumento. I monostrati coesi su entrambe le goccioline devono formarsi prima di riunirli per formare il bistrato.
Se le goccioline vengono riunite troppo presto, si uniscono e non si forma alcun bistrato. Stiamo ora progettando e fabbricando reti neurali di base microfluidiche costituite da neuroni a stato solido collegati da sinapsi basate su membrana supportate dall'ottimizzazione dell'assimilazione della rete di supercomputer ad alte prestazioni presso ORNL. Questi memristors sono i primi ad avere la composizione, la struttura, il meccanismo di commutazione e il trasporto ionica di sinapsi biologiche.
Forniscono così una base biomolecolare arredata aggiungendo calcolo e memoria simili a cervelli.
