呼吸間合質ウイルスに対する保護の重要なマーカーとして、RSV中和抗体を測定するための正確で高いスループット方法が必要です。この方法は、参照抗血清のアッセイ間の変動が10%未満であることで非常に再現性が高く、比較的低コストで世界中の多くの研究所でこのアッセイを容易に確立できると考えています。ここでは、RSVサブグループAで試験されたイメージングベースのマイクロ中和アッセイについて説明し、RSVサブグループB、および異なるサンプルタイプに適合させることもできます。
この手順のデモンストレーションは、MCRIの研究チームのメンバーであるルーベン・ツです。1日目にプレートをシードするには、まずDMEM培地でA549細胞を再懸濁し、10%FCSと1,000単位ペニシリン・ストレプトマイシン混合物を1ミリリットル当たり400,000細胞の濃度で再懸濁させた。その後、ウェルあたり100マイクロリットルの密度で40,000 A459細胞を持つ96ウェルフラットボトム滅菌プレートをシードします。
一晩で5%の二酸化炭素環境で摂氏37度でプレートをインキュベートします。2日目に血清希釈を調製するために、まずヒトRSV参照血清および血清検査サンプルを室温で解凍する。その後、加熱し、それらを活性化するために30分間摂氏56度の水浴にそれらを置きます。
次に、110マイクロリットル以上のリファレンスセラムを1.5マイクロリットルの参照血清とFCSフリーDMEM培地とペニシリンストレプトマイシン混合物と混合して、150マイクロリットルの最終体積に調製します。この希釈のピペット110マイクロリットルは、96ウェルU-底滅菌プレートのA12によく。シリアル1~2の希釈液をプレートに下ろすには、まずペニシリン・ストレプトマイシン混合物を含むFCSフリーDMEM培地55マイクロリットルをウェルB12〜H12に加えます。
その後、新しい先端で井戸A12からウェルB12に55マイクロリットルを移す。ピペットは5回上下して溶液を混合し、H12によく達するまで続けます。よくH12から溶液の過剰55マイクロリットルをオフにピペット。
次に、血清試験サンプルの1~100希釈液を調製し、各希釈液の110マイクロリットルを、対応するウェルA1からA9、E1から96ウェルの無菌プレートのE9に加える。その後、55マイクロリットルのFCSフリーDMEM培地をペニシリン・ストレプトマイシン混合物で追加し、1列から9列の井戸に加えます。前に説明したように、行 A から行 D、および行 E から行 H の順次 1 から 2 つのディリューションを作成します。
55マイクロリットルのFCSフリーDMEM培地をペニシリン・ストレプトマイシン混合物で、10列目と11桁目のウェルに加えます。ウイルスストックを準備するには、まず37°Cの水浴にRSVの冷凍バイアルを入れて急速に解凍し、次にバイアルを氷の上に置きます。次に、ペニシリンストレプトマイシン混合物を含むDMEM培地に、ウェルあたり約200 PFUでウイルスを加え、100ウェルの総容量を55ミリリットルにします。
ウイルス血清混合物を調製するために、まず、希釈されたウイルスの55マイクロリットルをカラム1〜9の全ウェルと列10および11のHを通る行Eの井戸に加える。次に、ペニシリンストレプトマイシン混合物を含むFCSフリーDMEM培地を列10と11のD行AからDのすべてのウェルに加え、5%の二酸化炭素環境で37°Cでプレートを1時間インキュベートします。RSVによるA549細胞の接種に先立ち、光学顕微鏡下で細胞板を調べ、A549細胞単層が80%コンフルエントであることを確認します。
その後、プレートを優しく反転して媒体を捨て、滅菌吸収性のペーパータオルで軽くプレートをブロットします。各後、濾過された滅菌PBSで洗浄する。次に、原稿に記載されているプレートテンプレートに従って、A549細胞プレート上の対応するウェルにウイルス血清混合物のウェルあたり100マイクロリットルを加え、5%の二酸化炭素で37°Cでプレートを1時間インキュベートします。
インキュベーションの最後に、ピペットを使用して1ウェルあたり90マイクロリットルを除去し、ペニシリン・ストレプトマイシン混合物に1XM199、1.5%CMC、および2%FCSを含む培地の100マイクロリットルを加える。3日間の5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。アッセイプレートを固定して開発するには、まずRSV感染A549細胞プレートを優しく反転させ、M199、CMC、2%FCS、ペニシリン・ストレプトマイシン混合物を含む培地を廃棄します。
その後、ゆっくりと各ウェルに固定バッファーの200マイクロリットルを追加します。マイナス20度でプレートを20分間インキュベートします。その後、固定バッファーを捨て、吸収性のペーパータオルにそっとブロットします。
プレートの面を下にして10分間乾燥させます。次に、05ポリソルベート20を含む濾過されたPBSバッファーで、5%乳遮断溶液を作る。各ウェルに200マイクロリットルのブロッキング溶液を加え、室温でプレートを30分間インキュベートします。
インキュベーションの終わりに、プレートを優しく反転させ、吸収性のペーパータオルに溶液を捨ててブロットします。一次抗体を作るために、ブロッキング溶液中の1~500ヤギXRSV抗体を希釈する。各ウェルに50マイクロリットルを加え、1時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。
ろ過したPBS-ポリソルベートでプレートを3回洗います。次に、ブロッキング溶液中の1~5,000個のアレクサフルーオールロバ抗ヤギ免疫グロブリンGを希釈して二次抗体を作る。各井戸に50マイクロリットルを加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。
ろ過したPBS-ポリソルベートで5回プレートを洗います。自動スポットリーダーでプラークをカウントするには、まず未使用の96ウェルカルチャープレートを使用して、FITCチャンネルにカウント設定を入力して機器をコラボレーションします。その後、セルプレートを読み、ホイルで包み、摂氏4度で保存します。
次に、実際のプラークまたは破壊された細胞単層の井戸の画像をチェックし、破壊された細胞単層を有する井戸を除外する。非血清制御ウェルのプラークの平均数を計算し、ウイルス活性の50%阻害をもたらす50%中和遮断を決定するために使用した。逆血清希釈は、x軸上にプロットし、2点間に引かれた線から半対数グラフのy軸上のプラークの数をプロットした。
試験血清サンプルの50%中和価は、赤および血清希釈と、無血清制御ウェルの50%値の直下または直下の数を有し、同定された。ガンビアの2つの異なる成人コホートとメルボルンの健康なボランティアのRSVAPRNアッセイは、ガンビアの成人がメルボルンの成人と比較して低い平均NABトワトレを有する結果をもたらした。示されたヒトRSV参照血清は、6.82%の変動係数を有する非常に低い変動性を示し、この改善された高スループットRSVプラーク還元中和アッセイは多くの研究室で容易に実施することができ、RSV中和抗体アッセイのためのWHOの国際的な調和の取り組みをサポートします。
これは、将来の新しいRSVワクチン候補の評価にとって重要です。
