この研究は、ワーゲニンゲン大学基金(WUF)、中国大学院生奨学金協議会プログラム、NWO-VIDI助成金12378によって部分的に支援されています。

1. 植物の成長と試験条件
<ol><li>18-22 °Cの温度範囲内で、自然光の体制の下で、または16時間/8時間の昼/夜体制で制御された温室または気候室で植物を成長させ、維持します。植物をより管理しやすくするために、腋窩枝を取り除きます。</li>
	<li>ジャガイモの場合は、ムラシゲ・スクーグ(MS)培地(20g/Lスクロース、ビタミン5g/L MS塩、8g/L寒天、pH 5.8)を含む無菌プラスチック瓶の中の体外プランレットを18°Cの気候室で制御された条件下で2週間維持し、その後、2週間の殺菌された土壌中のポットに移します。</li>
</ol>2. アグロインフィルトレーション
<ol><li>植物材料: ニコティアナベンタミアナのために、約4-5週の古い種子栽培植物を使用してください。ジャガイモの場合は、in vitroから4〜5週齢の移植を使用してください。浸潤のための若い、健康で完全に発達した葉を選択してください。</li>
	<li>
アグロバクテリウム 培養:<ol>
<li>YEB培地を事前に準備する(表1)。50 ml のチューブに 1 0 ml の YEB 培地を 1 μl アセトシリンギヨン (200 mM)、100 μl MES バッファー (2-(N モルフォリーノ)エタン スルホン酸、 1 M) と適切な抗生物質を加えます。所望の株のピペット20μlグリセロールストック(表2)(対象遺伝子を含む)をYEBに入す。このアッセイですべての アグロバクテリウム 株の培養を同時に開始する。28°Cで1~2日間、200rpm程度のOD600 に1~2日間振盪して細胞をインキュベートします。</li>
		<li>3,000 x g で 10 分間遠心分離して細胞を収穫します。上清を注ぎ、作りたてのMMA培地(表3)でペレットを0.3のOD600 に再懸濁します。穏やかに渦細胞はそれらを再中断する。2つの細菌株のコインフィルトの場合、培養液を1:1の比率で混合する。</li>
		<li>浸潤する前に1〜6時間室温でベンチに培養を残します。その間に、浸潤する植物と実験の日付にラベルを付けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>浸潤： 1mlの無針注射器を使用して 、アグロバクテリウム 懸濁液に浸透させます。注意深くゆっくりとシリンジからサスペンションで葉パネルを注入します(健康と安全上の理由から、このプロセス中に目の保護を着用する必要があります)。各株に対して少なくとも3つの植物に浸透する。トリプライズとして機能する植物ごとに3つの葉を使用してください。 注:通常、1 ml の アグロバクテリウム 懸濁液は 、N. ベンタミアナの 3 つの植物に十分な場合があります。ジャガイモの場合、 ソラナム 種の葉は浸透することがより困難であるため、より多くの懸濁液が必要です。サスペンションの必要量は 、ソラナム 種に依存します。手袋を交換したり、浸潤の間にエタノールで手袋を殺菌したり、接種の翌日まで植物に水をやらないようにすることで、クロスコンタミネーションを避けてください。</li>
	<li>採点： 細胞死表現型が明らかなとき、浸潤から約3日後に巨視的応答をスコア付けする(図1)。細胞死表現型が定量的である場合、与えられた基準を使用する(図2)。簡単に言えば、細胞死の巨視的スコアリングのスケールは、主に浸潤領域の細胞死率に依存する。細胞死の割合は、0%(症状なし)から100%(コンフルエント細胞死)までのスケールで描かれています。中間応答は、クロロシスなどの弱い応答から細胞死のレベルの増加まで多岐に及ぶ。必要に応じて、巨視的スコアリングは、現代の写真画像装置を使用して定量的に評価することもできる。</li>
</ol>3. PVXの農業感染
<ol><li>植物材料: ベンタミアナの場合は、2-3週齢の種子栽培植物を使用してください。ジャガイモの場合は、in vitroから2〜3週程度の移植を使用してください。大規模なテストのために、これらの植物は、アグロバクテリウム接種スポットの数を増やすために、より大きな葉を持っているように、わずかに古い(4-5週間)植物を使用してください。</li>
	<li>
アグロバクテリウム 培養:<ol>
<li>YEB培地を事前に準備してください。適切な抗生物質を補う3 ml YEBで10 mlのチューブを充填します。所望の株のピペット20μlグリセロールストック(表2)(対象遺伝子を含む)をYEBに入す。このアッセイですべての アグロバクテリウム 株の培養を同時に開始する。28°Cで1~2日間、200rpm程度のOD600 に1~2日間振盪して細胞をインキュベートします。</li>
		<li>各 アグロバクテリウム 株の約300 μlのピペットをLB固体寒天培地プレートに広げ、適切な抗生物質を添加し、28°Cで細胞を1〜2日間培養します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>感染 症： スパチュラを使用して、プレートに アグロバクテリウム 培養物を採取します。スパチュラの アグロバクテリウム 培養で木製のつまようじを浸し、葉を突き刺して大量の細菌を接種する。各株に対して少なくとも3つの植物を接種する。トリプライズとして機能する植物ごとに3つの葉を使用してください。各葉に、各株のための複数の接種部位を作る。</li>
	<li>採点： 接種後約2週間で、巨視的な反応をスコア付けする(図3)。ハイスループット画面の場合は、接種場所ごとに定性的応答(はい/いいえ)を記録します。次に、応答サイトの割合を計算し、コントロールと比較します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

農浸潤や農菌のような一過性のアッセイは、現代の分子植物病理研究に不可欠な効率的な方法です。いくつかの制限にもかかわらず、これらの方法は、プラントにおける効率的で堅牢な高スループット機能分析の需要を満たしています。
このアグロインフィルトレーションシステムは、植物種の範囲で広く使用されている機能アッセイである。アグロインフィルトレーションは、相互作用タンパク質の同時発現を伴う同じ細胞へのいくつかの遺伝子の送達を促進する。これは、R−AVR関係を再現する場合に、一致するR遺伝子を発現する株を有するAvr遺伝子を発現するアグロバクテリウム株をコインフィルトすることにより有利である。また、既知のR-AVR対に対して、そのようなコインフィルトは正の制御として使用することができる。このような制御を含む重要なのは、一部の植物遺伝子型において、応答を検出するための閾値を下回る変換効率が得られるためである。陰性コントロールを含む、例えば遺伝子挿入を伴わないベクターを含むアグロバクテリウム株は、ある種の植物遺伝子型がアグロバクテリウムに対する非特異的防御応答を上げるかどうかを判断することも不可欠である。この特徴は、ジャガイモの胚芽の特定の頻度で発生し、すべてのソラナム種は、このアグロバクテリウムベースの発現系に適しているわけではありません。一般的に、アグロインフィルトロートアッセイは、N.ベンタミアナおよびほとんどのジャガイモ遺伝子型で非常にうまく機能します。エフェクロミクスに加えて、遺伝子導入からのタンパク質の産生や植物細胞における共焦点顕微鏡によるタンパク質の局在化など、農浸浸法に関する様々な潜在的な用途があります。
PVXの農業感染は非常に敏感なスクリーニングシステムであり、典型的にはハイスループットのスクリーニングのためにより適している。 アグロバクテリウム は現在、局所的にしか存在しないため、PVXウイルスがトランスジーンのさらなる広がりを引き継ぐので、この細菌に対する非特異的な反応は今やあまり不安ではない。しかし、植物はPVXに対して耐性があり、または極度の抵抗性(ER)応答を取り付け、その場合は農菌感染法は適さない。PVXの農業感染方法のもう一つの制限は、目的の遺伝子の挿入サイズである。観察された表現型の応答は、創傷を取り巻く激しい黒壊死から接種場所付近のかすかな壊死までさまざまである。 N.ベンタミナ 種と ソラナム 種の両方で、PVXの農業感染は、農浸浸よりも敏感であると認識されている。
多様な試験された植物遺伝子型の遺伝的背景には、いくつかの制限がある(上記参照)ことを考慮に入れ、我々は一般的にPVXの農業感染および農浸濾過によって同様の結論を得る。これらの結果は、タンパク質浸潤29 およびELISA3などの他のアッセイで得られるのと同様にも同等である。両システムの長所と限界を考慮して、両方法を使用して互いを補完するか、独立した結果を確認することをお勧めします。

エフェクトロミクスは、近年、作物植物における耐性(R)遺伝子を同定する強力なツールとして、高スループット機能ゲノミクスアプローチが出現し、病原体のアビラレンス(Avr)遺伝子と一致する。R遺伝子を使用してより時間のかかる安定した変換とは対照的に、エフェトロミクス戦略は病原体遺伝子配列の一過性アッセイに基づいています。
ゲノミクス時代以降、植物病原体のゲノムは広く探求されてきました。例えば、最も壊滅的な植物病原体を含むoomycetesの場合、大規模な配列が生成され、植物5-10との相互作用の間に役割を果たす遺伝子について分析されている。病原体タンパク質の1つのクラスは、感染を促進するために宿主細胞の構造および機能を操作するエフェクターを表す(病原性因子)または防御応答(アビルール因子)11-13を誘発する。R遺伝子を含む植物細胞におけるAvr遺伝子の発現は、通常、過敏細胞死反応(HR)14,15をもたらす。RおよびAvr遺伝子のプランタ発現では、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス-ベースの一過性変換(アグロインフィルトレーション)16などの一過性発現系を用いて達成することができる。この一過性の変換は、ウイルス発現系(agro感染)17,18と組み合わせて適用することもできる。
アグロインフィルトレーションの場合、最も一般的に使用される薬剤は、ジコット植物の広範な宿主病原体である A.tumefaciens である。 タメファシエンス には、腫瘍誘発(Ti)プラスミドが含まれている。TiプラスミドからのDNA(T-DNA)の転写は、細菌の病原性機械が活性化された後に植物細胞に移入する。これは、傷ついた植物細胞において、わずかに酸性環境19で放出される低分子量フェノール化合物および単糖体によって引き起こされ得る。病原性遺伝子は、主要な静脈によって定義された葉パネルへの アグロバクテリウム 懸濁液の浸潤後に活性化される。そして、葉パネル内の植物細胞を形質転換し、T-DNA領域に含まれるトランスジーンを発現させます。
アグロ感染は、植物細胞へのウイルスの転座を媒介する創傷接種 性アグロバクテリウムに基づいています。その後、ウイルスはアグ ロバクテリウムの不在下で、隣接する植物組織にさらに広がる。農菌感染のために、いくつかの植物ウイルスを使用することができます。RNAウイルスは、感染した植物の非常に高いレベルに増殖することができるので、遺伝子発現のための理想的なベクターです。植物RNAウイルスの中でも、 ポテトウイルス X(PVX)は、エフェロミクススクリーンに広く使用されています。挿入遺伝子の機能試験を容易にするために、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターおよびノパリン合成酵素ターミネーターによって横たわるPVXゲノムを含むバイナリベクターを 、A.トゥメファシエンス20のT-DNAにクローン化した。T-DNAが植物細胞に移された後、T-DNAに含まれるPVXゲノムは、35Sプロモーターから転写される。その後、ウイルス粒子は感染した植物に全身的に広がり、その結果、挿入された遺伝子の発現が生じる。この方法は 、アグロバクテリウム とPVXの両方に基づいて、PVXのアグロパレンス感染と呼ばれています。
ここでは、農浸潤とPVXの両方の農業感染アッセイの例を示します。宿主植物として、エフェトロミクスのアプローチが開拓され、成功した3,4を証明したポテト胚芽(ソラナムセクションペトータ)を使用しています。我々はまた、ソラナス植物14,21,22のモデル植物として有名なニコチアナベンタミアナを使用しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

アグロインフィルトレーションとPVXのアグロパネシスは、植物の候補遺伝子の機能解析のための2つの効率的な一過性発現アッセイです。アグロインフィルグに最も一般的に使用される薬剤は、多くの二分植物種の病原体であるアグロバクテリウム・トゥメファシエンスです。これは、多くの植物種にアグロインフィルトレーションを適用できることを意味します。ここでは、これらの方法をジャガイモ(ソラナム結節)、その関連野生の塊茎を含むソラナム種(ソラナムセクションペトタ)およびモデル植物ニコティアナベンタミナにこれらの方法を適用する際に、我々のプロトコルと期待される結果を提示する。単一遺伝子の機能解析に加えて、抵抗性(R)またはアビロリジェンス(Avr)遺伝子、農浸浸法アッセイは、単にRとAvrトランスジーンを同じ細胞に送達することによって、特定の宿主病原体相互作用に関連するR-AVR相互作用を再現するのに非常に適している。しかし、いくつかの植物遺伝子型は、例えばいくつかのジャガイモの遺伝子型について観察されるように、アグロバクテリウムに対する非特異的な防御応答を上げることができる。アグロインフィルトレーションと比較して、PVXアグロプレシフィシンによるAVR活性の検出は、より敏感で、機能的なスクリーンでより高いスループットであり、アグロバクテリウムに対する非特異的な防御応答に対する感受性が低い。しかし、PVXに対する非特異的な防御が起こり、ウイルスによる極度の抵抗による応答を逃す危険性があります。このような制限にもかかわらず、我々の経験では、アグロインフィルトレーションとPVXの農業感染は、お互いの結果を確認するために同時に使用することができる適切かつ補完的なアッセイの両方です。

図1は、ジャガイモとN.ベンタミアナにおける7種類のエフェクター(E1-E7)を有するアグロインフィルトレーションの代表的な実験を示す。浸潤した約3日後に浸潤した葉パネルに細胞死が現れる。細胞死表現型の程度は、コントロールと比較する必要があります。 pBINplus-R3aおよびpK7WG2-AVR3aを含むAGL1(pVirG)23の混合物を陽性対照24,25として使用し 、AGL1(pVirG)を 陰性対照として使用した。図1Aおよび1Bは、それぞれ、アグロインフィルトレーションに非常に適したジャガイモ遺伝子型MaR8(マステンブロークR8)26およびN.ベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションの良い例を示す。葉パネルにコンフルエント細胞死は陽性対照で浸潤し、負のコントロールまたはpBINplus-R3aで細胞死反応は起こらない。MaR8では、AVR3a(E2)とAVR4(E3)の2つのエフェクターが細胞死を誘発し、他のエフェクター(E1およびE4-E7)は、N.ベンタミアナでは、どの試験されたエフェクタも細胞死応答を誘発しない。図1Cおよび1Dは、野生のジャガイモソラナムベルトオーティ483-1およびソラナム・リチェイ210-5におけるアグロインフィルトレーションの例を示しており、これは農浸浸法に適していない。S. berthaultii 483-1 では、葉の組織は、陰性コントロールおよびテストされたすべてのエフェクターに対する非特異的壊死を示す。S.レチェイ210-5では、浸潤した葉パネルは、陽性対照に対する非常に弱い細胞死応答を示す。
図2 は、アグロインフィルトレート されたアグロバクテリウムに対する応答を定量化するために使用できるスコア付けスケールの範囲を示しています。細胞死の割合は0-100%のスケールで描かれています。観察された表型は、マクロ的に目に見えない症状(0%)から、クロロシスを示す中間応答の範囲を通じておよび細胞死のレベルを増加させ、コンフルエント細胞死(100%)まで及ぶ。
図3 は、ジャガイモ中のPVXアグロ感染後の代表的な実験を示す。通常、拡大細胞死は、歯摘み接種の約2週間後に部位で見つけることができます。両図パネルに示すように、pGR106-CRN2(エフェクタークリンクラーCrn2を用いた陽性対照)を接種した歯ピックを接種した部位に細胞死の拡大が存在する、 これはP.出没遺伝子27から一般的な細胞死誘導遺伝子である。傷に対する軽微な応答とは別に、pGR106空(陰性対照)で接種された歯ピックの部位では、細胞死の拡大は記載されていない。 図3Aにおいて、ジャガイモの遺伝子型MaR3(マステンブロークR3)を表す、2つのpGR106-エフェクター(E1およびE2)は細胞死を誘発しなかった。 図3Bでは、野生の ソラナム・ワンカバンベンゼ 354-1におけるエフェクタースクリーニングの陽性結果が提示されている。細胞死応答は2つのpGR106エフェクター(E1-E3、エリシチンを表す)28に観察された。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> 図 1.ジャガイモおよびN.ベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションの例。植物は(A)ジャガイモの遺伝子型MaR8(マステンブロークR8)、(B)Nを含む。 ベンタミナ、 (C)ソラナム・ベルサーティ483-1 および(D)ソラナム・レヘイ210-5に、pBINplus-R3aおよびpK7WG2-AVR3a(陽性対照)を含むアグロバクテリウム株AGL1(pVirG)23の混合物で浸潤した、 7つのエフェクター(E1-E7)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示</a>できます。
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> 図 2.農浸潤応答の定量化写真は、0%(症状なし)から100%(コンフルエント細胞死)までの細胞死の代表的なスコアリングスケールを示しています。中間応答は、クロロシスなどの弱い応答から細胞死のレベルの増加まで多岐に及ぶ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示</a>できます。
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> 図 3.ジャガイモ中のPVXの農業感染の例。ジャガイモの遺伝子型MaR3(マステンブロークR3)(A)およびソラナム・ワンカバンベンゼ354-1(B)pGR106-CRN2(陽性対照)、pGR106空(陰性対照)およびpGR106-E1-2(エフェクター)、またはpGR106-E1-E13<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示</a>できます。
表 1.YEB培地
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>蒸留されたH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>蔗糖</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>牛肉エキス</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>細菌学的ペプトン</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>酵母エキス</td>
		</tr>
<tr>
<td>2ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2.アグロインフィルトレーションおよびPVXアグロパチンス感染に使用されるベクターおよび株。複数のバイナリベクトルを使用できます。以下のリストのベクターは、候補遺伝子の高い発現を可能にし、私たちの手の中でうまくいった。我々は、N.ベンタミアナでアグロバクテリウム株GV3101(pMP90)29を使用することを好み、ヘルパープラスミドpVirG(pBBR1MCS-5.virGN54D)23ジャガイモ31に適したAGL130を見つける。追加の株は、N.ベンタミアナを含む様々なモデル植物上の他のグループで分析されているが、ジャガイモ32ではない。
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: ゲートウェイバージョン36
表 3.MMA培地。 <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
pH を 5.6 に調整します。

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Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

アグロインフィルトレーションおよびPVXのアグロパネシスは、植物の遺伝子の一過性異所性発現に関する日常的な機能アッセイです。これらの方法は、エフェトロミクス戦略(迅速抵抗性およびアビルール遺伝子発見)における効率的なアッセイであり、分子植物病理における現代研究にとって極めて重要である。プラントでの堅牢な高スループット機能分析の需要に対応します。

ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

20.1K ビュー.  Wageningen University. アグロインフィルトレーションおよびPVXのアグロパネシスは、植物の遺伝子の一過性異所性発現に関する日常的な機能アッセイです。これらの方法は、エフェトロミクス戦略(迅速抵抗性およびアビルール遺伝子発見)における効率的なアッセイであり、分子植物病理における現代研究にとって極めて重要である。プラントでの堅牢な高スループット機能分...

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）でタバコbenthamianaとトマト

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

生物学

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

連続イメージングによる細胞死開始の定量化

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as the formation of cell death zones on inoculated leaves. Here, a protocol for studying the rate of cell death initiation by imaging inoculated leaves in the time between the cell death initiation and the cell death appearance using a digital microscope is presented. The digital microscope enables a continuous imaging process in desired intervals, which allows an accurate determination of cell death initiation rate up to minutes exactly, as opposed to hours in traditional methods. Imaging with the digital microscope is also independent of light and can therefore be used during day and night without disturbing the circadian rhythm of the plant. Different pathosystems resulting in programmed cell death development could be studied using this protocol with minor modifications. Overall, the protocol thus allows simple, accurate, and inexpensive identification of cell death initiation rate.

著者スポットライト:過敏反応における細胞死開始を研究するための合理化されたアプローチ 

Here we present a protocol for studying the rate of programmed cell death initiation by continuously imaging inoculated leaves following cell death induction.

デジタル顕微鏡を用いた細胞死開始の研究

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and diseases of the CPB are conducted during active feeding stages. Nonetheless, there are fewer studies on resting stages, although these beetles spend most of their life cycle in a state of winter diapause (hibernation). In this work, a method for investigating CPB hibernation under natural conditions was developed and tested, offering an opportunity to collect a sufficient number of individuals in winter. In this article, CPB survival was assessed, and infectious agents at different stages of hibernation were identified. CPB mortality increased during the hibernation, reaching a maximum in April-May. Entomopathogenic fungi (Beauveria, Isaria, and Lecanicillium) and bacteria Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, and Serratia were isolated&#160;from the dead insects. The survival rate of the beetles for the entire hibernation period was 61%. No frozen or desiccated beetles were found, indicating the success of the presented method.

Here we present a method for studying Colorado potato beetle hibernation under the natural conditions of the temperate zone as well as a technique for collecting beetles in winter. This method allows to obtain a desired number of overwintering individuals for various analyses at any stage of hibernation.

コロラドジャガイモ甲虫の自然環境下での冬眠に関する実験的研究

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

気候関連ストレス下におけるジャガイモのレジリエンス解析

High Throughput Image-Based Phenotyping for Determining Morphological and Physiological Responses to Single and Combined Stresses in Potato

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions over time. By using multiple imaging sensors, many traits of interest can be assessed, including plant biomass, photosynthetic efficiency, canopy temperature, and leaf reflectance indices. Plants are frequently exposed to multiple stresses under field conditions where severe heat waves, flooding, and drought events seriously threaten crop productivity. When stresses coincide, resulting effects on plants can be distinct due to synergistic or antagonistic interactions. To elucidate how potato plants respond to single and combined stresses that resemble naturally occurring stress scenarios, five different treatments were imposed on a selected potato cultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) at the onset of tuberization, i.e. control, drought, heat, waterlogging, and combinations of heat, drought, and waterlogging stresses. Our analysis shows that waterlogging stress had the most detrimental effect on plant performance, leading to fast and drastic physiological responses related to stomatal closure, including a reduction in the quantum yield and efficiency of photosystem II and an increase in canopy temperature and water index. Under heat and combined stress treatments, the relative growth rate was reduced in the early phase of stress. Under drought and combined stresses, plant volume and photosynthetic performance dropped with an increased temperature and stomata closure in the late phase of stress. The combination of optimized stress treatment under defined environmental conditions together with selected phenotyping protocols allowed to reveal&#160;the dynamics of morphological and physiological responses to single and combined stresses. Here, a useful tool is presented for plant researchers looking to identify plant traits indicative of resilience to several climate change-related stresses.

著者スポットライト:PlantScreenロボットプラットフォームを使用した非生物的ストレスに対する植物の反応の解明

We designed an image-based phenotyping protocol to determine the morphological and physiological responses to single and combined heat, drought, and waterlogging treatments. This approach enabled the identification of early, late, and recovery responses at a whole plant level, particularly above-ground parts, and highlighted the necessity of using multiple imaging sensors.

ジャガイモの単一および複合ストレスに対する形態学的および生理学的応答を決定するためのハイスループット画像ベース表現型

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions ...