チャールズ・ピノー、メラニー・ラガリグ、レジス・ラヴィーンの皆様に、植物サンプルのMALDIイメージングのサンプル調製に関するヒントやコツをお願いします。

1. サンプル準備
<ol><li>生物学的サンプルを入手し、それを新鮮でそのまま保つ(例えば、チューブに強制しないでください)か、それを凍結してください。提案されたプロトコルは、特定の組織の化合物を局所化するために、あらゆる種類の固体生物学的サンプル(すなわち、植物、動物、またはヒト組織)に適用される。</li>
	<li>クライオミクロトームを-20°Cに冷却します。 サンプルホルダーとブレードを同じ温度に保ちます。</li>
	<li>必要に応じて、オブジェクトを M1 埋め込みメディアに埋め込み、切断時に保持します。<ol>
<li>クライオミクロトームチャンバーに入れたプラスチック製の金型にマトリックスを注ぎます。迅速にサンプルを追加し、それをカバーするためにいくつかのより多くの埋め込み媒体を注ぎます。冷却中にマトリックスが固化するため、サンプルを金型の中央に維持します。 注:埋め込みは、すべての生物学的オブジェクトに必要ではありません。マウスの脳などの均質な物体は、埋め込み培地を必要とせず、凍結して切断することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>埋め込みサンプルまたは冷凍サンプルをクライオミクロトームホルダーに置き、鋭利な刃で切ります。5~30μmの厚さは、異質性のために切断が困難な植物サンプルに適しています。切断の厚さと温度をサンプルに合わせ、最良の条件を見つけるためにいくつかのカットを行います。提供した例では、試料を−20°Cで切断した。 サンプルの劣化を避けるために、サンプルを0°C以下に保つことを検討してください。 注:クライオミクロトームの隣に置かれた双眼鏡顕微鏡を使用すると、スライスの品質を決定するのに役立ちます。組織はそのまま残る必要があります。</li>
	<li>慎重に鉗子または小さい絵筆を使用してITOコーティングされたスライドにスライスを移動し、その後、サンプルをウォームアップし、乾燥するためにスライドの下に指を置きます。すべてのサンプルが準備ができるまで、スライドをクライオミクロトームチャンバーに保管してください。熱ショックを避けるためにゆっくりとチャンバーからスライドを取り出します。 メモ:スライドのどちら側がITOコーティングされているかを確認するには、室温(RT)でスライドに水滴を置きます。ドロップは、ITOコーティングされた側に丸いままになるか、コーティングされていない側に平らになります。</li>
	<li>薄いマーカーペンまたは補正液を使用してスライド上にマークを描画し、マトリックスの堆積前に高解像度スキャナでスキャンします。このマークは、質量分析計内にあるサンプルのスライド上の正確な位置を決定するために使用されます。正確な基準点を得る最善の方法は、十字を描く方法です。</li>
</ol>2. マトリックス蒸着
<ol><li>MALDIマトリックスを準備する:70mgのαシアノ-4-ヒドロキシシンミン酸(HCCA)マトリックスを秤量し、0.2%TFAで水とメタノール溶液(50:50)の10 mLで希釈します。RTで10分間マトリックスを超音波処理します。超音波処理後に余分な固体マトリックスがあるかもしれません。 注: MALDI 行列の種類は、対象の検数に応じて使用できます。</li>
	<li>マトリックス蒸着ロボットを100%メタノールで洗浄します。</li>
	<li>メタノールと精密ワイプを使用して、スライドを清掃し、サンプルに触れることなく、マークを取り外すことなく、スライドを清掃します。サンプルのない領域のスライドの上にきれいなカバースリップを追加します。スライドのその部分は、マトリックスの堆積を追跡するために光学検出器の上に配置されます。 メモ:マトリックスの厚さを光学的に追跡するには、スライドとカバースリップが非常にきれいでなければなりません。</li>
	<li>マトリクス堆積のためにロボットを使用する:6 mLのマトリックス溶液を貯蔵所に入れ、2mLを100%メタノールを加えて、合計体積8mLを加える。 注:堆積に沿ったマトリックスの厚さの記録は自動で、USBスティックを使用して回復することができます。噴霧法の開発についてはここでは詳しく説明していません。</li>
</ol>3. データ取得
<ol><li>MALDIプレート上にマトリックスの1μLを置き、マトリックスピークを基準として質量分析計を較正します。質量分析計の取得方法の開発については、ここでは詳しく説明していません。<ol>
<li>ソースに MALDI プレートを挿入し、ftmsControl ソフトウェアの [ターゲットのロード] をクリックし、プレートがロードされるのを待ちます。</li>
		<li>MALDIプレートを表す画像内のスポットをクリックして、マトリクススポットの位置を選択します。</li>
		<li>ソフトウェアの [サンプル情報] タブで、サンプル名とフォルダを指定します。</li>
		<li>「取得」をクリックして取得を開始します。</li>
		<li>取り込み中に、レーザーが異なるスポットをポイントするように、マウス ポインタを[MALDI ビデオ] タブで少し動かします。</li>
		<li>取得が完了したら、[校正] タブに移動し、 2 次モードでHCCA キャリブレーションリストを選択し、 [自動] をクリックします。グローバルキャリブレーション結果は「キャリブレーションプロット」ウィンドウに表示され、SolariX XR 7Tの場合は0.2ppm未満である必要があります。</li>
		<li>キャリブレーションが正常に行われれば、[承諾] をクリックして、メソッドを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルのマトリックスの堆積が完了したら、スライドをスライド アダプターに配置し、プラスチック カバーを使用してマークの位置を取得します。</li>
	<li>flexImagingソフトウェアでは、ソフトウェアで開く最初のウィンドウを使用して新しいイメージング実行を設定します。<ol>
<li>イメージング実行に名前を付け、 結果ディレクトリを選択して、[ 次へ] をクリックします。</li>
		<li>ラスター サイズ (つまり、ユーザー定義の測定領域) を指定し、使用する方法 (セクション 3.1 で調整) を選択し、[ 次へ] をクリックします。</li>
		<li>スライドをスキャンした後、ステップ 1.6 で取得したスライドの光学画像をロードし、[ 次へ] をクリックします。</li>
		<li>画像が広いウィンドウで開きます。スライドの位置を教えるためにスライド上のマークを使用してください: ftmsControlで、マークの正確な位置に MALDI ビデオ ウィンドウのターゲットを配置し 、felxImaging に戻って、光学画像上のまったく同じ点をクリックします。3 つの独立したポイントに対してこの操作を繰り返します。マークを付けたプラスチックカバーは、MALDIプレート上に置かれ、その位置を回復し、教えることを容易にします。 注:マークがマーカーで作られた場合、スライドの後ろに白い補正液を追加すると、教えの間に目立つ可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>「計測領域の追加」ツールを使用して、flexImaging ソフトウェアのサンプルに対象領域を描画します。</li>
	<li>複数のサンプルを解析する場合は、イメージングの実行と"AutoXecute シーケンス" を保存します。</li>
	<li>複数のサンプルを分析する場合は、"AutoXecute バッチ ランナー" を使用してシーケンスを起動します。 注: データを定期的に安全な場所に同期してください。</li>
</ol>4. データ処理
<ol><li>生データをビジュアライゼーション ソフトウェア (SCiLS Lab) にインポートし、データセットを作成します。これは、このソフトウェアの2つの別々のステップで行われます。<ol>
<li>[バッチインポータ] ツールを使用して、生データを選択し、ターゲット ディレクトリを指定して、[インポート] をクリックします。</li>
		<li>インポート後、複数のデータセットを組み合わせて、さらに分析することができます。データセットを結合するには、"ファイル|新しい|データセット" ツール。</li>
		<li>取得に使用する計測器のタイプを選択し、インポートしたデータセットを追加するには「+"」をクリックし、オブジェクトをクリックしてドラッグして画像を配置します。</li>
		<li>マス範囲の設定を確認するか、必要に応じて、対象範囲を指定して変更します。[ 次へ ] をクリックしてインポートの概要を表示し、インポートを開始します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルの異なる組織や異なるサンプルで、関心のある m/z を視覚化します。 スペクトル をクリックして対象の m/z を選択するか、または m/z ボックスに値を入力します。<ol>
<li>異なる組織や異なるサンプル間で共局化または判別型の値を検索する必要がある場合は、統計的検定を実行して、関心のある m/z を決定します。ツールは [ツール] メニューで使用でき、このプロトコルでは説明しません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>対象の m/z (たとえば、共局化された、判別型化合物) を、[ オブジェクト ] タブから.csv ファイルとしてエクスポートします。データセット全体が大きすぎない場合 (つまり、最大 60,000 行) エクスポートすることもできます。赤い矢印で示された対象地域の右側にある [エクスポート] アイコンをクリックします。</li>
	<li>.csv ファイルをインポートして、アノテーション ソフトウェア (Metaboscape) に新しいデータセットを作成します。「プロジェクト」をクリック|CSV プロジェクトのインポート".正確な m/z のみが考慮され、同位体プロファイルが失われることに注意してください。 注: 5.0 ソフトウェア バージョンでは、同位体プロファイルを考慮できるため、より正確なアノテーションを実現する視覚化ソフトウェアからデータを直接インポートできます。</li>
	<li>一般に公開されているデータベースから派生できるカスタム作成のアナライト リストで、アナタイズします。テンプレートは、ソフトウェアによって提供され、アナライトリストを作成します。</li>
	<li>予測ソフトウェア(代謝産物予測)を使用して、アノセトされた化合物の代謝産物のインシリコ予測を行う。対象化合物の開発された式は、ソフトウェアでユーザーによって描画されるか、または.molファイルとしてインポートされるのいずれかが必要です。その後、この方法は単純なステップバイステップのプロトコルです。</li>
	<li>代謝産物のリストを回復し、分析対象リストを作成し、アノテーション ソフトウェアで使用して、予測された代謝物で生データに注釈を付けます。または、代謝物のリストが短い場合は、ステップ 4.8 で手動で検索します。</li>
	<li>可視化ソフトウェアの生データにおける代謝産物の組織分布を可視化する。</li>
	<li>予測ソフトウェアの代謝プロセスに関与する酵素の名前を右クリックして、目的の予測代謝産物を右クリックして回復します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+aquatic+plant-based+systems:+A+review.">Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review.</a> Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).</li><li>Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+of+estrogens+on+human,+animal+and+plant+life:+A+critical+review.">Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review.</a> Environment International. 99, 107-119 (2017).</li><li>Prosser, R. S., Sibley, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+health+risk+assessment+of+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+plant+tissue+due+to+biosolids+and+manure+amendments,+and+wastewater+irrigation.">Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation.</a> Environment International. 75, 223-233 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+biochar+to+soils+may+result+in+plant+contamination+and+human+cancer+risk+due+to+exposure+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons.">Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons.</a> Environment International. 121, 169-177 (2018).</li><li>Marsik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+ibuprofen+in+higher+plants:+A+model+Arabidopsis+thaliana+cell+suspension+culture+system.">Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system.</a> Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+ibuprofen+by+Phragmites+australis:+uptake+and+phytodegradation.">Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation.</a> Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).</li><li>Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schr&#246;der, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+acetaminophen+(paracetamol)+in+plants-two+independent+pathways+result+in+the+formation+of+a+glutathione+and+a+glucose+conjugate.">Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate.</a> Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).</li><li>Thomas, F., C&#233;bron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+rhizosphere+effect+on+available+carbon+sources,+phenanthrene+degradation,+and+active+microbiome+in+an+aged-contaminated+industrial+soil.">Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).</li><li>Villette, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+micropollutants+and+associated+stress+response+in+Populus+nigra+leaves.">In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves.</a> Environment International. 126, 523-532 (2019).</li><li>Sandermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolism+of+organic+xenobiotics.+Status+and+prospects+of+the+'Green+Liver'+concept.">Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept.</a> Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).</li><li>Sula, B., Deveci, E., &#214;zevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+histopathological+changes+in+the+skin+of+rats+after+administration+of+lead+acetate.">Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate.</a> International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).</li><li>Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotics+metabolization+in+Salix+alba+leaves+uncovered+by+mass+spectrometry+imaging.">Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging.</a> Metabolomics. 15, 122 (2019).</li><li>Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Molecular+Analysis+of+Whole-Body+Animal+Tissue+Sections+by+Imaging+MALDI+Mass+Spectrometry.">Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルの重要な部分はサンプルの準備です: サンプルはソフトで、そのままでなければなりません。サンプルの温度と厚さは、試験したサンプルの種類によって異なる場合がありますので、切断は最も困難な部分です。動物組織は通常均質で、切りやすくなる。植物サンプルは、多くの場合、異なる構造を組み込むため、ブレードが柔らかい、硬い、または空の血管組織に遭遇する?...

ゼノビオティックは、人間の活動のために世界中に広く分布しています。これらの化合物のいくつかは、水溶性であり、土壌1によって吸収され、植物組織2、3、4に蓄積すると食物連鎖に入る。植物は、他の生物の餌食である昆虫や草食動物によって食べられます。いくつかの異種生物の摂取と植物の健康への影響は5、6、7、8と記載されていますが、最近では組織レベル9で説明されています。したがって、ゼノビオティックの代謝がどこでどのように起こるのか、または特定の植物代謝産物が特定の組織10における異種生物蓄積に相関しているかどうかはまだ不明である。さらに、ほとんどの研究は、植物の異種生物製剤とその代謝産物の代謝を見落としているので、植物組織におけるこれらの反応についてはほとんど知られていない。
ここで提案されるのが、反応の基質および生成物の組織局在化に関連付けることができる生体試料中の酵素反応を調査する方法である。この方法は、分析が非標的であり、目的の分析対象のカスタムリストを使用して調査することができるので、1つの実験で生物学的サンプルの完全な代謝プロファイルを描くことができます。提供された候補のリストは、元のデータセットで追跡されます。目的の1つまたは複数の検体がサンプルに記載されている場合、特定の組織局在化は、関連する生物学的プロセスに関する重要な情報を提供することができる。その後、対象の検体を関連する生物学的法則を使用して、インシリコで修飾して、可能な製品/代謝産物を検索することができます。得られた代謝産物のリストは、関与する酵素を同定し、組織の反応を局所化することによって元のデータを分析するために使用され、発生する代謝過程を理解するのに役立ちます。他の方法は、生物学的サンプルで発生する反応の種類、目的の化合物の局在化、およびそれらの関連代謝産物に関する情報を提供しません。この方法は、新鮮で無傷の組織が利用可能であり、関心のある化合物をイオン化することができると、任意の種類の生物学的材料に使用することができます。提案された議定書はVilletteら12 で出版され、科学界が使用するためにここに詳述されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cover slips</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">267942</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cryomicrotome</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Excel</td>
			<td style="width:163px;">Microsoft corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">flexImaging</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ftmsControl</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">GTX primescan</td>
			<td style="width:163px;">GX Microscopes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HCCA MALDI matrix</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8201344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ImagePrep</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ITO-coated slides</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">237001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">M1-embedding matrix</td>
			<td style="width:163px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Metabolite Predict</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Metaboscape</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No specific reference needed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MX 35 Ultra blades</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15835682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No specific reference needed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">SCiLS Lab</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">SolariX XR 7Tesla</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The method proposed is not limited to this instrument</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Spray sheets for ImagePrep</td>
			<td style="width:163px;">Bruker Daltonics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8261614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TFA</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No specific reference needed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of xenobiotics metabolism in salix alba leaves via mass spectrometry imaging

提示された方法は、異種生物薬にさらされたときに S.アルバ 葉の代謝プロファイルを確立するために質量分析イメージング(MSI)を使用しています。非標的アプローチを使用して、対象となる植物代謝産物および異種生物を特定し、植物組織に局在化して、特定の分布パターンを明らかにする。次いで、同定された異種生物由来の潜在的代謝産物(すなわち、異種物および共役体)のインシリコ予測が行われる。異種代謝産物が組織内に存在する場合、植物による変化に関与する酵素の種類が記録される。これらの結果は、葉の異種蓄積に応答して S.アルバ 葉で起こる生物学的反応の異なるタイプを記述するために使用された。代謝物は2世代で予測され、葉組織の異種生物を変換するための連続した生物学的反応の文書化を可能にした。

このプロトコルは、環境中の異種生物剤にさらされたS.アルバの木から採取された新鮮な葉に適用された。このプロセスを図1に示します。最初のステップは、目的のサンプルの薄いスライスを準備することです。植物サンプルは、組織が不均一であり、水や空気を含むことができるため、動物のサンプルよりも切断が困難であることが多いです。この難易度は、?...

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Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

この方法は、異種生物薬にさらされたときに S.アルバ 葉の代謝プロセスを理解するために質量分析法イメージング(MSI)を使用しています。この方法により、特定の無傷組織内で、目的の化合物とその予測代謝産物の空間的局在化が可能になります。

質量分析イメージングによる サリックスアルバ 葉における異種生物学的代謝の研究

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...

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Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

3.0K ビュー.  Université de Strasbourg. この方法は、異種生物薬にさらされたときに S.アルバ 葉の代謝プロセスを理解するために質量分析法イメージング(MSI)を使用しています。この方法により、特定の無傷組織内で、目的の化合物とその予測代謝産物の空間的局在化が可能になります。

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Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the development of new and innovative methods of mosquito control based around the Sterile Insect Technique (SIT)1-3. A control method known as RIDL&#160;(Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, is based around SIT, but uses genetic methods to remove the need for radiation-sterilization5-8. A RIDL&#160;strain of Ae. aegypti was successfully tested in the field in Grand Cayman9,10; further field use is planned or in progress in other countries around the world.
Mass rearing of insects has been established in several insect species and to levels of billions a week. However, in mosquitoes, rearing has generally been performed on a much smaller scale, with most large scale rearing being performed in the 1970s and 80s. For a RIDL&#160;program it is desirable to release as few females as possible as they bite and transmit disease. In a mass rearing program&#160;there are several stages to produce the males to be released: egg production, rearing eggs until pupation, and then sorting males from females before release. These males are then used for a RIDL&#160;control program,&#160;released as either pupae or adults11,12.
To suppress a mosquito population using RIDL&#160;a large number of high quality male adults need to be reared13,14. The following describes the methods for the mass rearing of OX513A, a RIDL&#160;strain of Ae. aegypti 8, for release and covers the techniques required for the production of eggs and mass rearing RIDL&#160;males for a control program.

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

To achieve population suppression of Aedes aegypti using the RIDL&#174; (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) system, large numbers of male mosquitoes need to be released. This requires the use of mass rearing techniques and technology to provide reliable systems to obtain the maximum number of high quality male mosquitoes.

ブラジルにおけるフィールドリリースのための遺伝子組み換え Aedes aegypti の大量生産

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

環境学

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

計算機シミュレーションを通してフォトバイオリアクターで藻類の成長を促進するために排煙設定を最適化

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

水生微生物Metaproteomicsワークフロー：細胞からのトリプシンペプチドのタンデム質量分析ベースの分析に適し

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to inorganic arsenic through diet, information about distribution of arsenic species in various food types must be generated. A method, previously validated in a collaborative trial, has been applied to determine inorganic arsenic in a wide variety of food matrices, covering grains, mushrooms and food of marine origin (31 samples in total). The method is based on detection by flow injection-hydride generation-atomic absorption spectrometry of the iAs selectively extracted into chloroform after digestion of the proteins with concentrated HCl. The method is characterized by a limit of quantification of 10 &#181;g/kg dry weight, which allowed quantification of inorganic arsenic in a large amount of food matrices. Information is provided about performance scores given to results obtained with this method and which were reported by different laboratories in several proficiency tests. The percentage of satisfactory results obtained with the discussed method is higher than that of the results obtained with other analytical approaches.

The usefulness of an analytical method to determine inorganic arsenic in a wide range of food matrices is demonstrated. The method consists of selective extraction of inorganic arsenic into chloroform with a final determination by hydride generation-atomic absorption spectrometry.

無機ヒ素で、広い範囲の食品行列水素化物発生 - 原子吸光法を使用して分析します。

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

葉の木の粒子状物質の除去能力を評価します。

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

あたりを識別する-ポリフルオロ化学種の結合対象・非対象と検診高分解能質量分析ワークフロー

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Investigation of Plant Interactions Across Common Mycorrhizal Networks Using Rotated Cores

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi influence plant mineral nutrient uptake and growth, hence, they have the potential to influence plant interactions. The power of their influence is in extraradical mycelia that spread beyond nutrient depletion zones found near roots to ultimately interconnect individuals within a common mycorrhizal network (CMN). Most experiments, however, have investigated the role of AM fungi in plant interactions by growing plants with versus without mycorrhizal fungi, a method that fails to explicitly address the role of CMNs. Here, we propose a method that manipulates CMNs to investigate their role in plant interactions. Our method uses modified containers with conical bottoms with a nylon mesh and/or hydrophobic material covering slotted openings, 15N fertilizer, and a nutrient-poor interstitial sand. CMNs are left either intact between interacting individuals, severed by rotation of containers, or prevented from forming by a solid barrier. Our findings suggest that rotating containers is sufficient to disrupt CMNs and prevent their effects on plant interactions across CMNs. Our approach is advantageous because it mimics aspects of nature, such as seedlings tapping into already established CMNs and the use of a suite of AM fungi that may provide diverse benefits. Although our experiment is limited to investigating plants at the seedling stage, plant interactions across CMNs can be detected using our approach which therefore can be applied to investigate biological questions about the functioning of CMNs in ecosystems.

Most plants within communities likely are interconnected by arbuscular mycorrhizal (AM) fungi, but mediation of plant interactions by them has been investigated primarily by growing plants with versus without mycorrhizas. We present a method to manipulate common mycorrhizal networks among mycorrhizal plants to investigate their consequences for plant interactions.

回転コアを使用して一般的な菌根菌ネットワークを介した植物相互作用の研究

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi influence plant mineral nutrient uptake and growth, hence, they have the potential to influence plant interactions. The ...

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural losses. To understand the biology of such pest moths, fundamental techniques have been in high demand. Here, methods for mass-rearing, observations, and molecular studies are developed using two tea tortrix, Homona magnanima and Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insects were mass-reared with sliced artificial diet and maintained by inbreeding for over 100 generations by considering their biological characteristics. Insects have various sex dimorphisms; hence it is difficult to distinguish the sex during the developing stages, which have prevented subsequent assays. The present work highlighted that the sex of tortricids larvae could be determined by observing testes or lactic-acetic orcein staining to visualize the female-specific W chromosome. Moreover, using the sex determination methods, the present study enabled nucleic acid extractions from sex determined embryos and application toward high throughput sequencing. These tips are applicable for other pest insects and will facilitate further morphological and genetic studies.

The present protocol describes the rearing method of tortricid pest insects in the laboratories. The procedures to distinguish insects' sex and extract nucleic acids for high throughput sequencing are established using two tortricid pests.

トルトリシダ科害虫の大量飼育と分子研究

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...

質量分析イメージングによる サリックスアルバ 葉における異種生物学的代謝の研究

質量分析イメージングによるサリックスアルバ葉における異種生物学的代謝の研究