著者らは、マウスを飼育するためのUCデービスマウス生物学プログラムに感謝したいと思います。この研究は、メルク、ダルムシュタット、ドイツからの助成金によってサポートされていました。

すべての動物実験及び実験は、カリフォルニア大学デ​​ービスインスティテューア​​ニマルケアと管理諮問委員会を使用することによって承認されたプロトコルの下で実施された。 1。 MUC1.Tgマウス繁殖と伝播<ol><li>ヘテロ接合MUC1.Tg C57BL / 6雌マウスとUCデービスマウス生物学プログラム（MBP）は、品種、野生型C57BL / 6雄マウスたちの繁殖コロニーを確立する。 MUC1.Tg子孫は、必要に応じて研究のために提供されています。 </li><li> MBPの担当者はマウスの識別のために定義されたパターン（0-99）に子孫のつま先をクリップし、該当する場合、クリップ尾。つま先又はテール組織は、標準的なDNA抽出およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析を用いて遺伝子型決定のために処理される。 </li></ol> 2。研究デザイン<ol><li>研究グループの割り当て<ol><li>バランスに個別に各マウスを秤量し、各マウス用グラムの体重を記録します。 </li><li> INV手順のこの部分研究の方法論と設計olves。研究の最初の部分については、OH-BBNと膀胱癌の誘導を開始するために年齢をマッチさせたMUC1.Tgと野生型マウスを割り当てる。組織学による膀胱腫瘍の存在を確認するために8週間最後O​​H-BBNを投与後、マウスを安楽死させる。 </li><li>試験の第二部分は、治療群と対照群の適切な数に雄MUC1.Tgマウスをランダム。これらのマウスは8週最後のOH-BBNを投与後誘導および腫瘍の発生時に、その後の研究の終了時に血清サイトカインおよびT細胞免疫応答のために監視されます。 </li></ol></li><li>膀胱癌誘発<ol><li> OH-BBNは発癌物質と非常に有毒である。この化学物質を処理し、格納するときの材料安全データシートのガイドラインを読み、それに従ってください。 </li><li>平均的な重みとnumbeに基づいて、各マウスに、100μlの量で適切な用量（3 mg）を、実現するために必要な投薬溶液濃度を計算それぞれの研究とグループのマウスのR。 </li><li> 100％エタノールでOH-BBNを希釈。滅菌水で30 mg / mlのへの最終濃度を持参してください。最終エタノール：水の濃度は20:80、V / Vでなければなりません</li><li> 8週齢から始まる治療群の割り当てに基づいて、ステンレス鋼、20 G強制飼養針毎日、5日/週、12週間を使ってOH-BBN経口を管理します。 </li></ol></li><li>ワクチン接種トリートメント<ol><li>再構成では、各0.9％滅菌生理食塩水600μlの中に凍結乾燥したペプチドワクチンのバイアル、徹底的6X 0.5インチ27 G針を通してソリューションを描くことによって再懸濁します。生理食塩水を使用して、所望の用量を100μLの容量で提供されるように濃度を調整します。 </li><li> OH-BBNの最後の投与後、25 G針（週番号は、マウスの年齢に相当）を使用して、100μlのの皮下注射による8週間のサイクルのために週単位でワクチンを投与、20週以降。 </li></ol></li><li>モニタリングとサンプルコレクション<ol><li>すべてのマウスを秤量し、毎週一回、新しい腫瘍の有無を触診。明白な腫瘍、尿中の血液、および/または尿閉がある場合、または体重の≥20％を失っている任意のマウスを安楽死させる。 </li><li>以前は最初のOH-BBN線量にしてから、4週間間隔で、その後、顎下出血を経由して全血を収集します。血清凝固チューブ（BD Microtainer）中の血液を収集し、血液凝固のために30分を可能にします。 </li><li> 10分間、3,500×gで遠心で血液サンプルを遠心分離。慎重にピペットを用いてキャップクライオチューブをネジに血清を移す。 </li><li>フラッシュ液体窒素中で凍結し、-80℃で保存多重によるさらなる分析までC。 </li><li> 8週間OH-BBNの最後の投与後、CO 2窒息によりすべてのマウスを安楽死させる。 </li><li>解剖ボード上の各マウスを置き、すべての4つの手足によって突き止める。 </li><li> MAは、鉗子やハサミを使うKE上腹部の水平切開。表皮層と腹壁の間に切開にはさみを入れ、静かに鉗子の助けを借りて、下にある組織から肌を分離。 </li><li>マウスの前方終わりに向かって中央の軸に続く水平切開から縦切開を加えます。胸郭から肌を分離し、1ミリリットルのシリンジと22 G針を用いて、穿刺心と円滑かつ着実なドローで血を集める。 </li><li>血清分離と貯蔵のために2.4.3と2.4.4のステップを参照してください。 </li><li>鉗子やハサミ、カットと裏表皮層の残りの部分を使用。腹壁と腹膜を通してカットし、無菌的に免疫組織化学（IHC）とウエスタンブロットのために膀胱腫瘍を取り除く。 </li><li>細胞の生存分析（ミューズ）とエリスポット用脾臓を収集します。 IHC、場所膀胱腫瘍組織カセット内の試料と室温で冷やしたホルマリン一晩で解決するために。 </lI&gt; <li>翌日、70％エタノールでホルマリンを置き換える。 </li><li>腫瘍のウェスタンブロット分析については、腫瘍を均質タンパク質抽出バッファープラスホールトプロテアーゼ阻害剤を追加し、1.5 mlのマイクロチューブに移す。 </li><li> 30〜60秒間ボルテックスし、氷上で5分間保持する。 Flashには、周囲の水に液体窒素で凍結融解。 、ボルテックス凍結倍解凍のプロセスを繰り返します。 </li><li> 4で10分間°C、10,000×gでサンプルを遠心分離して、新しいラベルしたチューブに細胞抽出物を転送します。 </li><li>タンパク質測定用ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（BCA）を行うことにより濃度を定量化する。ストアサンプル-80℃でウェスタンブロット分析のための準備ができるまでC。 </li></ol></li></ol> 3。分子生物学/ウェスタン以下の手順は、標準的なウェスタンブロットプロトコルを使用して、マウスの膀胱腫瘍組織におけるMUC1の発現を確認するために行った（データは示さないn）でなければならない。 <ol><li>半乾燥装置を用いてPVDF膜上に転送してSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によってタンパク質抽出物を分離。 </li><li>リン酸0.1％、5％脱脂乳とタンパク質転写した膜をブロックのTween-20は、室温でオービタルシェーカーで1時間生理食塩水（PBS-T）pH7.4のバッファ付き。 </li><li> 0.1％PBS-Tにおける抗MUC1または抗β-アクチン抗体を用いてシェーカー上で室温で1時間、膜をインキュベートする。 </li><li>ソリューションをデカントし、0.1％PBS-Tを追加することにより、膜を洗浄します。 5分間デカント用シェーカー上渦巻膜。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体と室温で1時間、膜をインキュベートする。 </li><li> 3倍の（3.4のステップを参照してください）​​洗ってください。 </li><li>透視をアクティブにして読むために強化された化学発光（ECL）キットのためのプロトコルに従ってください。 </li></ol> 4。プレックス蛍光マイクロビーズイムノアッセイ &lt;OL&gt; <li>セットアップと計算<ol><li> 96ウェルプレートマップを使用して、ウェルに空白、標準、コントロール、および未知を割り当てます。分析物、捕捉抗体、アッセイに必要なストレプトアビジン - フィコエリトリン（SA-PE）の数と体積を計算する。 </li><li>すべてのバッファおよび希釈は室温に平衡化することができます。空白の96ウェルプレートを用いて基準とサンプル希釈液を調製する。 </li><li>製造元のプロトコールと96ウェルプレートの適切な希釈剤と標準の1時05分の段階希釈を作るに従って血清マトリックスと凍結乾燥標準再構成。ブランクウェルには、適切な希釈剤を使用しています。 </li><li> 96ウェルプレートの残りの部分で適切な希釈剤ですべてのコントロールと未知試料1:2希釈する。 </li><li>ビーズミックス、15 mlチューブに適切な希釈剤の必要量をピペット。ボルテックス20秒とピペットは、各ビーズのバイアルを15mlチューブに各検体の必要量。 </lI&gt; <li>常に光退色を避けるために、光からビーズを守る。ウィッキングを通してサンプルの損失を避けるために、吸収材で96ウェルプレートに置かないでください。 </li></ol></li><li>アッセイプロトコール<ol><li>アッセイ緩​​衝液200μlで96ウェルフィルター底板を予め湿らせ、フィルタの完全な浸漬が可能になります。静かに96ウェルプレートの真空装置を用いて排出し、ペーパータオルでプレートの底を乾燥ブロット。 </li><li>マルチチャンネルピペット、空白および標準コントロールと未知数のために割り当てられたウェルにアッセイバッファーのピペット25μlのために割り当てられたウェルに血清マトリックスのピペットを25μlを使用。 </li><li>ブランク、標準、コントロール、およびそれぞれの割り当てられたウエルに未知数のピペット25μlの。ボルテックス20秒ビーズミックスとリザーバーにビーズを移す。 </li><li>各ウェルにビーズミックスピペット25μlの。アルミ箔や光から保護するための不透明なプレートカバーをしてプレートをカバーしています。 </li><lI&gt;プレートシェーカー上で室温で2時間500rpmでプレートを振る。ドレインと0.1％200μlのリン酸のTween 20とプレートを洗う二回（PBS-T）緩衝生理食塩水。ドレインとドライブロット。 </li><li>捕獲抗体溶液を準備します。 0.1％PBS-Tの必要量をピペットで10秒、15 mlチューブと渦に抗体を捕捉。各ウェルに貯水池とピペット25μlに捕捉抗体ミックスを転送します。 </li><li>プレートシェーカー上で室温で1時間500rpmでプレートを振る。回を排出し、0.1％PBS-T200μlでプレートを洗浄する。ドレインとドライブロット。 </li><li> SA-PE溶液を調製。 15ミリリットル管と10秒間ボルテックスに0.1％PBS-TとSA-PEの必要量をピペット。各ウェルに貯水池とピペット25μlの解決策を移す。 </li><li>プレートシェーカー上で室温で30分間、500 rpmでプレートを振る。回を排出し、0.1％PBS-T200μlでプレートを洗浄する。ドレインとBたくさん乾燥。 </li><li>ピペット100 0.1％PBS-Tμlの、ビーズを再懸濁するために、少なくとも2分間500rpmでプレートシェーカーで振る。ルミネックスLX200マシン上のプレートを読み、分析します。 </li></ol></li></ol> 5。 IFN-γ/IL-4エリスポットの準備と分析<ol><li>生物学的安全キャビネットでは、100μmのナイロン組織を介して脾臓を処理を5 mlの滅菌リン酸にふるい生理食塩水（PBS）は、滅菌ペトリ皿にバッファ。滅菌15mlのチューブにリンパ球分離培地3mlの上にレイヤ脾細胞を。 </li><li>赤血球からリンパ球を分離し、15分間600×gで遠心する。新しい無菌の15 mlチューブにグラデーション上記レイヤードリンパ球を転送します。 </li><li>滅菌PBSで10mlまで音量を調整します。ペレット細胞に10分間600 xgでサスペンションを遠心分離。 </li><li>上清を吸引し、細胞生存のために1mlのPBSで細胞を再懸濁しミューズを数えるアナライザ。ミューズカウント＆生存キットのプロトコルに従ってください。 </li><li> 1.5 mlのスクリューキャップ遠心1:10の希釈要因でチューブ、1:20、およびCount＆生存試薬で1:40（または必要に応じて）（最小総量を300μl）中のリンパ球の段階希釈を作る。ミューズにミックスし、分析するには、上下に数回、各希釈ピペット。 </li><li>エリスポットプレートのためのサンプルと条件のプレートマップを準備します。製造元のプロトコールと培地のピペットを100μl、ペプチド（10μgの/ ml）を、またはスクランブル各ウェルにペプチド（10μgの/ ml）をに従ってエリスポットプレートを準備します。 </li><li>各ウェルに1.0×10 6個の細胞を提供し、37℃で一晩静置し、細胞懸濁液をピペットで100μlを、。 </li><li> ELISPOTアッセイのために、製造業者のプロトコルに従ってください。解剖顕微鏡を使用して開発されたエリスポットプレートを分析します。 </li><li>着色されたスポットcorrespondiの数をカウントすることによって結果を定量化各ウェル中の各分析にNG。スポットは、各ウェルのスポット形成細胞数（SFC）に対応しています。 </li></ol> 6。免疫組織化学（IHC）とヘマトキシリン​​＆エオジン（H＆E）染色<ol><li>免疫組織化学的分析のためには4μmでパラフィンおよびステップ部に埋め込む上記のように保持膀胱腫瘍組織（セクション2.4.11）を取る。 </li><li> MUC1のタンデムリピート領域を認識MUC1抗体を用いたIHCを実行します。組織に存在する内因性免疫グロブリン二次マウス抗体の反応性を最小限にするために動物実験キットペルオキシダーゼを使用します。 </li><li>標準プロトコルを使用して、H＆E染色を行う。 </li></ol> 7。統計的方法多重蛍光マイクロビーズのイムノアッセイのために、平均値を比較するために両側スチューデントt-検定を使用して治療群と対照群との間血清サイトカイン濃度を観察した。エリスポットについては、1-Wを使用メディアコントロールの間にコロニーを形成するスポットを比較するAY ANOVAは、ペプチドおよびペプチドのグループをスクランブル。偽陽性の結果の可能性を軽減するためにDunnettの多重比較検定を使用してください。 ≤0.05のp値は、すべての分析のために大きく異なると考えられている。

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Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).</li><li>Hughes, O., Denley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+mucin+expression+in+transitional+cell+carcinoma+of+the+bladder:+a+target+for+diagnosis+and+therapy+with+monoclonal+antibody+C595.">MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595.</a> J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).</li><li>Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+immunity+to+MUC1+in+a+human+MUC1+transgenic+murine+model.">Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model.</a> Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).</li><li>Mukherjee, P., Madsen, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effects+of+L-BLP25+antigen-specific+tumor+immunotherapy+in+a+novel+human+MUC1+transgenic+lung+cancer+mouse+model.">Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model.</a> J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).</li><li>Kunze, E., Schauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+transformation+in+the+development+of+N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced+transitional+cell+carcinomas+in+the+urinary+bladder+of+rats.">Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats.</a> Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).</li><li>Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+human+bladder+carcinogenesis.">Experimental models of human bladder carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).</li><li>Samma, S., Uemura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+carcinoma+in+situ+in+dog+urinary+bladder+by+sequential+treatment+with+N-methyl-N'-nitrosourea+and+N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.">Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.</a> Gann. 75 (5), 385-387 (1984).</li><li>Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+bladder+urothelial+cancers+in+the+rabbit+by+dibutylnitrosamine+with+an+artificial+bladder+calculus+as+cocarcinogen.">Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen.</a> Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).</li><li>Irving, C. C., Tice, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced+urinary+bladder+cancer+in+rats+by+administration+of+disulfiram+in+the+diet.">Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet.</a> Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).</li><li>Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-BLP25+vaccine+plus+letrozole+induces+a+TH1+immune+response+and+has+additive+antitumor+activity+in+MUC1-expresssing+mammary+tumors+in+mice.">L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice.</a> Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).</li></ol>

DPV、GTW、SMG、CJK、AMG、そしてGKHは競合する利益を宣言しません。 MWDは、メルクKGaA社から受け取った助成金の主任であり、MWはメルクの従業員である。

人間MUC1.Tgマウスの侵襲的移行と扁平上皮膀胱癌の正常な誘導は免疫療法の開発のための前臨床モデルを提供しています。免疫療法の研究では、経時的に腫瘍の進行に対する炎症応答、ならびに免疫療法に対する免疫応答を評価するために、自発的、免疫無傷のモデルの使用を必要とする。自発的な腫瘍の開発モデルにおいて、腫瘍微小環境はそのまま残り、腫瘍は治療の抗腫瘍効果の評価を...

膀胱がんは、がんの第四の最も一般的な形式とアメリカの男性のがんによる死亡の第八の主要な原因である。米国では、膀胱癌からの推定72,500の新しい症例と15,000人が死亡、2013年1で組み合わせるの男性と女性の間で期待されている。膀胱癌の発生率は女性に比べ男性で高い約3倍である。症例の90％以上を占める米国、移行上皮癌（TCC）で、一方、扁平上皮癌（SCC）は、2％未満2の発生率を持っている。乳頭TCCの全体的な相対5年生存率はSCC 2のための唯一の30.9％に比べて91.5パーセントである。非侵襲的な乳頭のTCCも患者の50％以上の治療よりは、筋肉侵襲性疾患3,4に進行し、これらの患者の30％までで、5年以内に再発を経験すると、診断時の症例の約75％を占めていますが。 INV非筋肉の典型的な治療レジメンasive病気は膀胱内化学療法に続いて経尿道的切除術（TUR）が含まれています。高品位のTaまたはT1腫瘍を有する患者では、リピートTURは、化学療法3,4の前に行ってもよい。低悪性度のTa再発またはハイグレードのTaまたはT1病変を有する患者については、TURはカルメット-ゲランが（BCG）3,4を使用することができバチルスの形で補助化学療法や免疫療法が続く。膀胱内BCGは、再発までの時間5に対する膀胱マイトマイシンCよりも優れていることが示されている。 T2筋肉侵襲性疾患については、術前化学療法の有無にかかわらず根治的膀胱切除術は、治療3の推奨コースです。 SCC患者において、ラジカル膀胱切除は、最も効果的な治療6であると思われる。利用可能な最善の治療法にもかかわらず、再発の非常に高い率を考えると、膀胱癌のための新しい、より効果的な治療法の必要性が明らかに存在する。 bladdに対する新しい免疫療法を拡大えーがんは、無病生存期間を延長するための約束を保持することができる1つの可能なアプローチである。歴史的に、BCGは膀胱癌のための唯一の効果的な免疫療法となっています。その作用機構は増加するインターロイキン-2のレベル（IL-2）およびインターフェロンγ（IFN-γ）4を介してTヘルパー1（Th1型）型免疫応答の非特異的誘導が関与すると考えられている。携帯電話、またはTh1型免疫は、体液、またはTh2のような癌免疫療法において重要である、免疫が成長因子受容体7に対する抗体を除いて、固形腫瘍に対して有効であることが示されていない。 BCG単独療法の利点を改善する試みでは、IFN-α2B/BCGコンビネーション免疫療法は、決定的な結果は8との第II相臨床試験で評価した。膀胱癌に対する免疫療法の代替アプローチは7癌免疫療法は、より具体的な行った識別そのうち腫瘍関連抗原（のTAA）を、ターゲットにするかもしれない</s&gt;まで。 そのようなTAAは、例えば膀胱癌、乳癌、肺癌および膵癌9,10などの多くの上皮細胞癌において過剰に発現する細胞表面糖タンパク質であるムチン-1（MUC1）である。 MUC1の発現及び変更は、実質的発癌の間に変更され、その結果underglycosylationは、ペプチドコア上のタンデムリピートの可変数（VNTR）として知られているアミノ酸の抗原配列が公開されています。 MUC1は、自己分子であるが、これらの免疫VNTR領域は、通常、広範なグリコシル化のために露出されないので、それらは外来11,12などの免疫系によって見られる。具体的にはMUC1エピトープを認識する細胞傷害性Tリンパ球（CTLが）MUC1のための潜在的なターゲット作り、乳癌患者13と同様に、骨髄腫患者14,15の血液および骨髄の腫瘍流入領域リンパ節から単離されている細胞性免疫応答。 underglycosylateの免疫VNTRsMUC1のD形は、腫瘍細胞の16-19の破壊をもたらし、CTLにより認識されています。癌MUC1へのネイティブ細胞および/または体液性免疫応答は、しかし、腫瘍を除去するために十分な強さではありません。 MUC1に対する既存の弱い免疫応答を増強するために、合成ペプチドが免疫優性臨床的利益18,20からなるのに十分に強いCTL応答を生成するためにワクチン接種を介して導入することができる。 MUC1リポソームワクチンは既に、肺癌患者21,22の生存率を増加させるMUC1陽性腫瘍細胞を死滅させることができるCTLを生成し、Th1型偏サイトカイン応答23,24を生成することが示されている。 MUC1発現を9,11,25の高いレベルでは、膀胱癌は、MUC1特異的免疫療法26,27をテストするための論理的な候補である。さらに、MUC1は膀胱癌28で予後因子としての可能性を秘めている、TCCにおけるMUC1の発現が有意ステージとグレードに関連付けられており、転移性TCCMUC1 29を発現し続けることが示されている。 膀胱癌におけるMUC1特異的免疫療法の潜在的な有用性を評価するために、我々は、免疫無傷のヒトMUC1（hMUC1）を発現するC57BL / 6背景に30膀胱癌ジェニックのトランスジェニック（MUC1.Tg）マウスモデルを開発した。ヒトMUC1は、ヒト30,31において観察されるそれと一致した組織発現パターンを得、自身のプロモーターの制御下で自己タンパク質として発現される。マウスは、公知の膀胱発癌物質N-ブチル-N-（4 -ヒドロキシブチル）ニトロソアミン（BBN-OH）32で誘導した後、得られた腫瘍hMUC1発現と腫瘍の種類や悪性度を評価した。腫瘍現像時のTh1/Th2サイ​​トカインレベルに発癌物質の効果を評価するために、血清サンプルを多重分析のために定期的に収集した。次いで、マウスをターゲットMUC1ペプチドワクチンで処理し、血清サイトカインおよび免疫応答があった評価多重蛍光マイクロビーズイムノアッセイとエリスポットによってテッド。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>B0938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G Gavage Needles</td>
			<td>Popper &#38; Sons, Inc.</td>
			<td>7921</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Vaccine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>investigational agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainers</td>
			<td>BD</td>
			<td>365957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassettes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M490-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokine 20plex Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LMC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Microsphere Beads</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>MC100xx-01</td>
			<td>xx is the bead region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Capture Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Detection Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>554415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Capture Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Detection Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab83136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-MAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokine Standard</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MXM8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-screen HTS 96well filter plates</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSBVN1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 m Nylon Tissue Sieves</td>
			<td>BD</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splenocyte Separation Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-829E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF- /IL-4 ELISpot plates</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ELD5217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>2900-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-actin monoclonal antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W401B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SC-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean TGX Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Count &#38; Viability Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MCH100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC1 Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550486</td>
			<td>IHC antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Research Peroxidase Kit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K3954</td>
			<td>IHC staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore plate vaccum apparatus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Lx200</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>40-013</td>
			<td>Manufactured by Luminex, distributed by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Xponent Software</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 3.1; included with Luminex Lx200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milliple Analyst Software</td>
			<td>Milliplex / VigeneTech</td>
			<td>40-086</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Software</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 1.1.0.0; included with Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Unitron</td>
			<td>Z730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism Software</td>
			<td>Graphpad Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot SD Cell and PowerPac</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-3849</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of invasive transitional cell bladder carcinoma in immune intact human muc1 transgenic mice:  a model for immunotherapy development

浸潤性膀胱癌の前臨床モデルは、ヒトムチン-1（MUC1）免疫療法および/または細胞傷害性化学療法を評価するためのトランスジェニック（MUC1.Tg）マウスにおいて開発された。膀胱癌を誘発するために、C57BL / 6マウス（MUC1.Tgおよび野生型）は、3.0 mg /日で発癌物質N-ブチル-N-（4 - ヒドロキシブチル）ニトロソアミン（BBN-OH）、5日/週で経口的に処理した12週間。腫瘍の開発中に血清サイトカインプロファイルにOH-BBNの効果を評価するために、全血を処理し、4週間ごとに先立って顎下出血を介して収集した。また、MUC1ターゲットペプチドワクチンおよびプラセボを8週間毎週マウスの群に投与した。腫瘍の発生と次の予防接種時の血清サイトカインの多重蛍光マイクロビーズimmunoanalysesを行った。終了時に、インターフェロンγ（IFN-γ）/ MUC1特異的T細胞免疫応答および腫瘍型の組織病理学的評価のためのインターロイキン-4（IL-4）のELISpot解析そして等級を行った。その結果、（1）MUC1.Tgと野生型マウスの両方における膀胱癌の発生率は67％であった。（2）2:1の比率で開発された移行上皮癌（TCC）は、扁平上皮癌（SCC）に比べ（3）炎症性サイトカインは、腫瘍の発達の間に経時的に増加し、（4）ペプチドワクチンの投与は、Th1型偏血清サイトカインプロファイルおよびMUC1特異的T細胞応答を誘導する。 MUC1.Tgマウスで全ての腫瘍はMUC1発現について陽性であった、とMUC1.Tgと野生型マウスのすべての腫瘍の半分は侵襲的であった。結論として、薬理学者、免疫学者、病理学者と分子生物学の努力の調整を通じてチームアプローチを使用して、我々はhMUC1を表現膀胱癌の免疫無傷トランスジェニックマウスモデルを開発しました。

膀胱癌における新規免疫療法との組み合わせの効果の前臨床評価は、適切な動物モデルの開発が必要である。我々のトランスジェニックマウスモデルでは、化学発癌物質OH-BBNによる誘導は、ヒトの膀胱癌に類似しているいくつかのSCC、と主にTCCの膀胱癌の発生率の高さとなった。腫瘍組織学、MUC1発現状態とペプチドワクチン治療に対する免疫応答を決定するために、21 MUC1.Tgと18野生型マウス...

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Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

N-ブチル-N-（4 - ヒドロキシブチル）ニトロソアミン誘発性膀胱癌モデルは、ヒトムチン-1（MUC1）テストの目的MUC1特異的免疫療法のためのトランスジェニックマウスに開発された。ターゲットMUC1ペプチドワクチンを投与した後、MUC1の細胞傷害性Tリンパ球応答は、血清サイトカインレベルおよびT細胞特異的活性を測定することにより確認した。

免疫無傷のヒトMUC1トランスジェニックマウスにおける侵襲移行細胞膀胱癌の誘導：免疫療法の開発のためのモデル

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

induction-invasive-transitional-cell-bladder-carcinoma-immune-intact

Research

JoVE Journal

Medicine

21.1K ビュー.  University of California, Davis. N-ブチル-N-（4 - ヒドロキシブチル）ニトロソアミン誘発性膀胱癌モデルは、ヒトムチン-1（MUC1）テストの目的MUC1特異的免疫療法のためのトランスジェニックマウスに開発された。ターゲットMUC1ペプチドワクチンを投与した後、MUC1の細胞傷害性Tリンパ球応答は、血清サイトカインレベルおよびT細胞特異的活性を測定することにより確認した。

ビデオ: Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

医学

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body temperature that is observed during fever. The use of hyperthermia as an adjuvant has emerged as a promising procedure for tumor regression in the field of cancer biology. For this purpose, the most important requirement is to have reliable and uniform heating protocols. We have developed a protocol for hyperthermia (whole body) in mice. In this protocol, animals are exposed to cycles of hyperthermia for 90 min followed by a rest period of 15 min. During this period mice have easy access to food and water. High body temperature spikes in the mice during first few hyperthermia exposure cycles are prevented by immobilizing the animal. Additionally, normal saline is administered in first few cycles to minimize the effects of dehydration. This protocol can simulate fever like conditions in mice up to 12-24 hr. We have used 8-12 weeks old BALB/Cj female mice to demonstrate the protocol.

This paper describes a protocol for whole body hyperthermia in mice that can stimulate fever like conditions up to 12-24 hr.

マウスの長い持続時間の全身温熱療法のためのプロトコル

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

小型げっ歯類における膀胱内圧測定の使用：膀胱Chemosensationの研究

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

免疫不全マウスの皮下および肝内ヒト肝細胞癌異種移植片の生成

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

マウスの膀胱痛に対するモデルとしての膀胱膨満誘発内臓運動応答

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

マウスにおける顔面神経軸索切断：傷害に運動ニューロン応答を研究するためのモデル

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

マウスにおける加速アテローム性動脈硬化症の誘導:ワイヤー傷害モデル

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

左室肥大の誘導マウスにおける低侵襲の横大動脈狭窄のテクニック

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

癒しの標準化された生体力学的条件下でマウスの軟骨破壊を分析する低侵襲モデル

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...