これらのプロトコルは、免疫調節器攻撃の抗腫瘍活性を研究する効果的な方法を提供します。さらに、循環サイトカインおよび免疫細胞集団における関連する可能性の分析は、これらの提案された方法を使用して行うことができます。このプロトコルの主な利点は、腫瘍を移植し、その成長を監視する簡単で簡単な方法であることです。この手法の直接的な意味は、抗がん研究における特定の治療法または課題の有効性を評価することです。さらに、これらの技術のいくつかの側面は毒性試験に適しています。まず、マウスEERL細胞の凍結バイアルを摂氏37度の予熱水浴で解凍し、温かい培地を含む15ミリリットルのコニカルチューブに移します。コニカルチューブをGの277倍で25°Cで5分間遠心分離し、培地を除去します。次に、細胞口蓋を3〜5ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁し、T25細胞培養フラスコに移します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で加湿したインキュベーターで細胞を成長させ、より大きなフラスコに拡張し、3日ごとに通過させます。すべてのマウスに所望の移植に十分な細胞ができたら、フラスコを取り出し、培地を捨て、細胞PBSを穏やかにすすいでください。次に、4ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを加え、摂氏37度で2分間インキュベートします。新しい培地を添加してトリプシン反応を停止し、細胞懸濁液を50ミリリットルのコニカルチューブに回収します。細胞を新鮮な培地に再懸濁し、細胞を数えます。もう一度遠心分離し、細胞に冷たいPBSを添加して、最終濃度を1,000万細胞/ミリリットルにします。注射前に細胞懸濁液を氷上に保管してください。脇腹をエタノールパッドで消毒します。マウスに細胞懸濁液を注入するには、100マイクロリットルの細胞懸濁液をシリンジに吸引し、上部からすべての気泡とデッドスペースを取り除きます。次に、細胞懸濁液を麻酔をかけたマウスにゆっくりと着実に皮下注射します。動物をそれぞれのケージに入れ、麻酔から回復するまで監視します。採血するには、利き手ではない方の手で肩越しに緩んだ皮膚をつかみ、18ゲージの針またはランセットで顎下静脈に穴を開けます。200〜300マイクロリットルの血液を1.5ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心チューブまたは血清分離チューブに集めます。採血後、出血が止まるまで穿刺部位に穏やかな圧力をかけます。マウスをそれぞれのケージに戻し、麻酔から回復するまで観察します。採取した血液を室温で20〜30分間凝固させます。次に、遠心分離の準備が整うまでチューブを氷上に置きます。凝固した血液をGの1, 540倍で摂氏4度で15分間遠心分離し、上から血清層を慎重に収集します。血清または血漿サンプルを氷上に保持しながら解凍します。次に、サンプルを1, 540倍Gで5分間、摂氏4度で遠心分離し、細胞破片を沈殿させ、上部から血清層を慎重に収集します。マルチプレックスキットを室温に置き、メーカーのプロトコルに従ってアッセイを実施します。各マウスを仰向けに寝かせ、腹部の皮膚に70%エタノールをスプレーします。鉗子とハサミを使用して、マウスの右側からリンパ節を切除し、左側から腫瘍を切除します。腫瘍が大きい場合は、腫瘍を細かく切り、組織から約500〜600ミリグラムを取り除きます。3〜5ミリリットルのRPMI培地が入ったそれぞれの解離チューブに組織を配置します。自動解離装置を使用して組織を均質化します。ホモジナイズ後、細胞懸濁液を70マイクロメートルフィルターで濾過し、50ミリリットルの円錐管に入れます。Gの277倍で25°Cで5分間遠心分離し、培地を除去します。細胞を洗浄し、1〜2ミリリットルの冷たいPBSで再懸濁します。0.4%トリプシンブルー染色を用いて、血球計算盤で生細胞をカウントします。200万から300万個のセルを取得し、それぞれのファックス管に転送するために必要な容量を計算します。遠心分離機は、上清を25°Cで5分間Gの277倍で細胞をカウントし、上清をデカントし、細胞を300マイクロリットルのPBSに再懸濁します。チューブ1本あたり0.5マイクロリットルから1マイクロリットルのゾンビ色素を加え、室温で暗所で20分間インキュベートします。細胞を遠心分離する 1〜2ミリリットルのファックスバッファーで細胞を洗浄し、200マイクロリットルのファックスバッファーに再懸濁します。メーカーのプロトコルに従ってFC受容体遮断薬を添加し、細胞を10分間インキュベートします。前述の設定で再度遠心分離し、1〜2ミリリットルのファックスバッファーで細胞を洗浄します。抗体カクテルを加え、暗所で摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、遠心分離し、細胞を1〜2ミリリットルのファックスバッファーで洗浄します。300〜400マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒド溶液を加え、固定のために再懸濁します。細胞を摂氏4度で数日間保存するか、マルチカラーフローサイトメーターですぐに分析します。本研究では、ポリ無水物IL-1の抗腫瘍活性
