我々のプロトコルは、HIV-1感染性周期を維持するウイルス、ヌクレオラー、および非ヌクレオラー宿主因子の同定と特性評価のための代替方法を提供する。このアプローチで使用される概念は、研究対象経路の特徴付けを必要とする他のウイルスおよび疾患モデルに適用可能である。他のタンパク質モデルへの変更に関するトラブルシューティング手法について説明します。
この手順のデモンストレーションは、希望都市ベックマン研究所の分子細胞生物学部門の科学者であるハイタン・リーとプリツァナ・チョムチャンと、希望の市プロテオミクスコアと分子免疫学科のメンバーであるロジャー・ムーアです。HLfBを安定して発現させるHLfBを、3つの100ミリメートル培養プレートで、1ミリリットル当たり2倍の10〜6個の細胞に培養します。細胞が適切な濃度に達したら、Revヌクレオラー局在化シグナル3素旗変異を含むプラスミドを15ミリリットルチューブに1.76ミリリットルのTE 79/10と混合し、続いて2モル塩化カルシウム240マイクロリットルを添加し、徹底的に混合する。
次に、チューブの内容物を2倍HBSの2ミリリットルを含む新しい15ミリリットルのチューブに滴下し、続いて渦盤で混合する。室温で30分後、降水を渦出させる。培地をそっと渦巻きながら、3枚の100ミリメートルHLfB培養プレートのそれぞれに滴下する懸濁液の1ミリリットルを加えます。
細胞培養インキュベーターで6時間のインキュベーションを行った後、トランスフェクション混合物を10ミリリットルの新鮮な培養培地に置き換え、さらに42時間培養器に細胞を戻します。トランスフェクションの48時間後、各プレートをバイオハザードレベル2の組織培養フード内の氷のベッドの上に置きます。細胞培養培地を取り出し、細胞層を破壊することなく、10ミリリットルのプレチルPBSで細胞を穏やかにリンスする。
細胞をすすいだ後、PBSを捨てます。次に、細胞を1皿あたり1ミリリットルのリシスバッファーで処理し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加する。プレートを傾けてセルをプールに集め、セルスクレーパーを使用して手動で層を破壊します。
1,000マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、各プレートからリセートをプレチル、15ミリリットルのチューブにプールし、氷の上で15分間インキュベートし、5分ごとに渦を出します。インキュベーションの終わりに、ライセートを3本の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにアリコートし、遠心分離によってライセートを回収する。上清を新しい15ミリリットルチューブに移し、原稿に記載されているようにウイルスタンパク質のライセート濃度を得る。
Revヌクレオラー局在化シグナル3本分旗の共免疫沈降については、M2アフィニティゲルビーズ25マイクロリットルを500マイクロリットルの新鮮なライシスバッファーで3回洗い流し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、洗浄1回。冷たい部屋で、または氷の上の試薬でこれらのステップを実行します。最後のすすみ後、5ミリリットルのリシスバッファーの最終体積で、リンスビーズにウイルスタンパク質ライゼートの1ミリグラム/ミリリットル濃度を加えます。
反応を摂氏4度で3時間回転させてインキュベートします。インキュベーションの終わりに、遠心分離によってウイルスタンパク質のリセート結合ビーズをペレット化する。免疫沈降後のタンパク質濃度の測定のために上清を収集します。
サンプルの保管手順については、原稿を参照してください。ウイルスタンパク質のリセート結合ビーズペレットに750マイクロリットルのリシスバッファーを加え、ビーズを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、ビーズを摂氏4度で5分間ローテーターで洗浄します。ちょうど示したように、ローテーター上の追加の2回の打ち付けのための遠心分離によってビーズを収集します。
最後の洗浄後、つままれた長いゲルローディングチップを使用して、ビーズ-コインムヌノ沈降複合体からリシスバッファーの痕跡を除去します。2xローディングバッファの55マイクロリットルにビーズを再中断します。その後、95°Cで10分間沸騰させます。
1つのウェスタンブロットゲルと1つのクマシー染色SDS-PAGEゲルに25マイクロリットルの溶出物をロードします。SDS-PAGEゲル電気泳動終了後、25ミリリットルの超純水でゲルを15分間3回リンスします。最後の洗浄後、100ミリリットルのクマシー染色試薬をゲルに加えます。
完全な染色プロトコルについては、原稿を参照してください。ゲルバンドの消化のために、最初にきれいなカミソリの刃を使用して、各突然変異を表すゲルのレーン全体からゲルバンドを約5ミリメートルの立方体に切断する。各バンドを清潔な0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れる。
バンドを100ミリモルの重炭酸アンモニウムで2回、1対1のアセトニトリル対水溶液で室温で15分間覆います。その後、ゲル片を真空遠心分離機で5分間乾燥させます。タンパク質を減らすために、乾燥したゲル片を100ミリモルのジチオトライトールで100ミリモル炭酸アンモニウムで覆い、摂氏56度で1時間培養し、続いて水中で100ミリモルのヨウ酢酸アルキル化を水中で1時間水中で1時間暗濁時に1時間覆います。
次に、ゲル片をアセトニトリルで2回収縮させ、再膨れ上げし、続いて100ミリモルモルの重炭酸アンモニウムを室温で穏やかに振りかけて15分間再収縮させる。2回目の再膨潤後、ゲル片を真空遠心分離機で5分間乾燥させます。100ミリモルの重炭酸アンモニウムで、シーケンシンググレードの改変トリプシンのマイクロリットル当たり50ナノグラムのゲル片を膨潤させる。
5分後、ゲル片を100ミリモルの重炭酸アンモニウムで覆い、完全に再膨れ上がりさせ、100ミリモルのアンモニウム重炭酸塩を加えて、膨らんだゲル片を完全に覆います。次いで、ゲル片を摂氏37度で一晩インキュベートし、翌朝水に10%のギ酸を入れてサンプルの体積の1/10で反応を止め、各チューブから上清を集める。Revヌクレオラー局在化シグナル3素旗は、種々の濃度の塩化ナトリウムを含む3つの異なるライシス緩衝条件下で検出可能である。
B23は、より低い塩濃度を含むリシス緩衝液においても検出可能であり、培地塩濃度を含むリシス緩衝液では検出がやっとであり、高塩濃度を含むリシス緩衝液では検出できない。B23検出は、野生型Rev3-プライムフラグを有する低塩化ナトリウム濃度を含有するリシスバッファーにおいて最適であり、Revヌクレオラー局在化シグナルM1 3素旗との親和性を失う。野生型Rev 3-プライムフラグとのB23アフィニティーも塩濃度が高くなると減少し、pcDNA陰性対照は、両方のリシス緩衝条件下での免疫沈降後の非特異的免疫検出を生じさせない。
Revヌクレオラー局在化シグナル3プライムフラグは、2倍のサンプルローディングバッファで沸騰を通して溶出した後に最も検出可能であり、B23は37°Cおよび95°Cの両方のサンプルバッファインキュベーション条件下で検出可能です。免疫沈降および銀染色後、実証されているように、野生型RevおよびRevヌクレオラー局在化シグナルM2、M6、M9は18キロダルトンで検出可能である。B23タンパク質に相当するバンドも37キロダルトンマーカーで観察される。
クマシー試薬による染色は、18キロダルトンでの変異の有無に関するRevヌクレオラー局在化シグナル3素旗の検出可能性をさらに示す。潜在的な結合因子のトラブルシューティングおよびスクリーニングプロセス中に疾患モデルに関連する参照に必要な数のコントロール(正と負の両方)を使用してください。すべての欠失および単一点突然変異は野生型Revを用いた多量体化を通じて支配的陰性活性について調べることができ、HIV-1複製の逮捕に利用される。
