This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unit&#224; per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

<ol>
	<li>Druillennec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mimic+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+impairs+reverse+transcription+and+displays+antiviral+activity.">A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).</li><li>Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+functions,+and+drug+targeting+of+the+multifunctional+nucleocapsid+protein+of+the+human+immunodeficiency+virus.">Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus.</a> Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).</li><li>Thomas, J. A., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+protein+function+in+early+infection+processes.">Nucleocapsid protein function in early infection processes.</a> Virus Res. 134, 39-63 (2008).</li><li>Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features,+processing+states,+and+heterologous+protein+interactions+in+the+modulation+of+the+retroviral+nucleocapsid+protein+function.">Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function.</a> RNA Biol. 7, 724-734 (2010).</li><li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleation,+reverse+annealing,+and+chaperone+function+along+the+reaction+path+of+HIV-1+single-strand+transfer.">Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).</li><li>Basu, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand+transfer+events+during+HIV-1+reverse+transcription.">Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription.</a> Virus Res. 134, 19-38 (2008).</li><li>Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+nucleocapsid+protein+promotes+efficient+strand+transfer+and+specific+viral+DNA+synthesis+by+inhibiting+TAR-dependent+self-priming+from+minus-strand+strong-stop+DNA.">Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA.</a> J Virol. 71, 5178-5188 (1997).</li><li>Godet, J., Mely, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+studies+of+the+nucleic+acid+chaperone+properties+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> RNA Biol. 7, 687-699 (2010).</li><li>Darlix, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+nature+and+specific+functions+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).</li><li>Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+nucleic+acid+annealing+activities+of+nucleocapsid+protein+from+HIV-1.">Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1.</a> Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).</li><li>Vo, M. -. N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+mini-TAR+RNA/DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).</li><li>Beltz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+for+cTAR+DNA+binding+and+destabilization,+and+correlation+with+inhibition+of+self-primed+DNA+synthesis.">Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis.</a> J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).</li><li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+Protein:+a+Desirable+Target+for+Future+Therapies+against+HIV-1.">Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1.</a> Curr Top Microbiol Immunol. , .</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis+and+biological+evaluation+of+TAR+and+cTAR+binders+as+HIV-1+nucleocapsid+inhibitors.">Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors.</a> MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).</li><li>Tabarrini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Anti-HIV+Transcription+Inhibitor+Quinolones:+Identification+of+Potent+N1-Vinyl+Derivatives.">Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives.</a> Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).</li><li>Hagan, N., Fabris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mass+spectrometric+determination+of+the+stoichiometry+and+binding+affinity+of+the+complexes+between+nucleocapsid+protein+and+RNA+stem-loop+hairpins+of+the+HIV-1+Psi-recognition+element.">Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element.</a> Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).</li><li>Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+RNA+chaperone+proteins:+from+functions+to+disease.">Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease.</a> Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).</li><li>Zagotto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+G-quadruplex+vs+double-stranded+DNA+recognition+in+regioisomeric+lysyl-peptidyl-anthraquinone+conjugates.">Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates.</a> Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).</li><li>Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferred+RNA+binding+sites+for+a+threading+intercalator+revealed+by+in+vitro+evolution.">Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution.</a> Chem Biol. 10, 663-672 (2003).</li><li>Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+duplex+RNA+by+helix-threading+peptides.">Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides.</a> J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).</li><li>Kanevsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+TAR+RNA-DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

NAMEは急速​​にHIV-1、新規な抗HIV薬の探索において興味深い標的のヌクレオキャプシドタンパク質のシャペロン活性の阻害を評価することができるアッセイである。 NCは、高速かつ、その安定した折りたたみそうで注意深いアニーリングに続いて、高温で熱変性を必要とする室温の核酸でアニーリングする。アッセイは、いずれの完全長NCまたは切り捨て（12から55）NCで行うことができます。どちらの場合も2核酸（RNAおよびその相補DNAコピー）が急速にアニールされる。これは、切断NCペプチドと文献の観察と一致している：アニーリングが弱いNC結合部位でその相補心尖ループの相互作用に続くCTARのステムの効率的な溶融によって開始される、TAR心尖ループの相補的配列と、延長アニーリングしたハイブリッドには、いくつかの不安定な中間体を通って終わる。21 NCは非常に安定であるのprotEINといくつかの問題が実行NAMEが発生する可能性がありながら。これが達成されていない場合に、ゲルが正しい位置での核酸バンドを示さない。しかしバッファ反応を停止するために使用されるゲルのロードで作りたてのSDSを追加することが非常に重要である。実際には、正確にゲル電気泳動によってTAR / CTARのヘテロを視覚化するように、NCは、核酸結合タンパク質であるタンパク質を変性させ、核酸との緊密な複合体からそれを解放するためにLoading Bufferをゲル中に存在しなければならない。これはまた、ゲル、実行時 ​​にシフトしたバンドの形成すなわち実験の可能性のトラブルシューティング、である。この効果は、完全長のNCは、 図2のように、採用されたときに特に顕著であり、核酸に強い凝集効果を有する、高度に塩基性のN末端 ​​尾部の存在にリンクされている。 ターミナル基本尾の存在がショーとして、抑えることがアニーリング反応をより困難にするnは化合物1、代表スレッディングインターカレーターを用いて、図3に、TARおよびCTARのステムループ構造を安定に特に効率的なインターカレーター、すなわち 。実際には、核酸との相互作用のこのタイプは、バルジおよびループが塩基対に嵩高い置換基を容易に糸通しを可能にする、二重らせんの連続性を中断するときに有利である。これらの核酸結合剤によってTARとCTARの安定化は、以前に二つのオリゴヌクレオチドの融解温度の上昇を測定することにより分析した。14また、融解温度の上昇は、HIV-1 NCによって触媒アニーリングの阻害と相関するヘテロ二重TAR / CTARの減少形成につながるとスレッディングインターカレーターは、TAR要素としてRNAの動的な構造のためのバインダーの興味深いクラスであることを示している。14 作用機序は、これらのコンポのために呼び出さ図4に示すようにundsはさらに、別の代替フォーマットでNAMEアッセイを行うことによって確認することができる：薬物二つ折り畳まオリゴとともにインキュベートされたときにインターカレーターの場合、アニールヘテロの阻害が増強される。このようなNC蛋白質の直接の結合剤としての作用の異なる機構に作用する化合物は、以下の異なるプレインキュベーションモードによって影響を受ける。 NAMEアッセイは、したがって、NC阻害剤の同定のための化合物のライブラリーをスクリーニングするために使用することができる二つの方法で行われ、NCを対象に抗HIV薬を探している間にも正のヒットの作用の推定メカニズムを評価する。明らかに、識別されたNC阻害剤の特定の作用機構に主張単独でこれらの技術を使用することは十分ではなく、他の適当な生化学的ア ​​ッセイは、作業仮説を維持するために必要とされる。14 最後に、NAMEは非常に使用していることを強調しなければならない組換えまたは合成のいずれかに精製酵素、試験した化合物によるNCの「 インビトロ 」阻害に関する貴重な情報を与える。これはアッセイの「強さと弱さ」です：NAMEはよく迅速に構築し、解析する構造活性相関を、最終的に合成し、薬剤設計をリダイレクトすることが可能、仮想スクリーニングおよび創薬プログラムの予備的段階における分子モデリングアプローチを補完することができます。しかし、HIVにおける薬剤開発プロジェクトで使用される他の生化学的アッセイとして、NAMEは、ウイルス感染細胞における推定阻害剤の効果についての情報を与えることはありません。

ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のヌクレオカプシドタンパク質NCp7（NC）がしっかりと逆転写中に補因子としてウイルス複製に重要な役割を果たして、成熟した感染性ウイルスゲノムRNAと関連している小さな塩基性タンパク質であるゲノムの認識、および包装1-3 NCは、安定な核酸構造の不安定化と相補的な配列のアニーリングを触媒核酸シャペロンとして作用する。デュプレックス不安定化活性は、そのジンクフィンガー構造（12-55ペプチド）にマッピングされているが、その核酸凝集活性が11アミノ酸で主にN末端 ​​ドメインが存在する。4、正に帯電したタンパク質は、アニーリング反応の静電障壁を低下させ二つの別々の相補的配列が一緒になる速度を増加させる。 安定した立体配座に折り畳まれた核酸はfacilitatするNCのシャペロン活動を必要とする電子彼らのアニーリングを5これはNCは鎖転移イベントにおいて重要である逆転写、特に重要である：。マイナス鎖転送において、 マイナス鎖停止 DNAは、単にレトロ転写、R領域に相補的な配列に転送され、アニールされなければならない熱力学がRNAゲノムの3 &#39;末端にテンプレート6は 、この反応によりR領域中のトランス活性化応答領域 （TAR）RNAの安定した構造の存在のためにNCの不存在下で広範に発生していない、そのは、そのDNAコピー（CTAR DNA）。特徴的なステム-ループ構造を持つ7 CTARとTARが、実際には、高度に構造化された領域に関連付けられている必要があります。 NC蛋白質は、これらのヘアピンを変性し、相補的な核酸鎖間の分子間のアニーリングの速度を増加させることにより、マイナス鎖の転送を促進する。 TARとCTARのNCアニーリングのメカニズムを徹底的に調査し、デされましたいくつかの研究論文でTARアニールアッセイとしてスクライビングと提案方式が優れたレビューに描かれている。8-11要約、NCは、そのようなTAR-RNAなどの安定したRNAの二次構造を不安定にその相補的配列の二次構造を不安定化、CTAR-DNA 、およびTAR / CTARヘテロ形成につながるRNA / DNAのアニーリング反応を促進する。10,11により、HIV複製中鎖転移工程が有利で ​​ある。12 NCをNCに向かって小分子によって誘導される潜在的な干渉が損なわNC活性の結果として、ウイルスゲノムの逆転写の低下をもたらすので、新たな抗ウイルス剤の開発のための魅力的な標的である。2,13このアプローチは可能性最終的に成功した抗HIV薬の開発につながる。 NCのスクリーニングの過程で、我々は、よく知られた特性に頼るアッセイを開発し14阻害剤効率的に相補的なオリゴヌクレオチドを不安定化アニールするヌクレオカプシド。10,11の私たちは、Nが nnealing- Mは、Eの lectrophoresis（NAME）アッセイをediated ucleocapsidそれと呼ばれる。 NAMEアッセイは、ハイブリッドTAR / CTARヘテロを生成するその相補的DNA配列（CTAR）とTAR-RNA配列の先端部に対応するオリゴヌクレオチドの我々の場合、相補的核酸の安定的に構造化されたコピー間のアニーリングを仲介するNCを使用して。 NCの存在下でTAR / CTARアニーリング反応の分析は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって調べることができる。 このプロトコルは、反応および実験の可能性のトラブルシューティングの結果を分析する方法を、急速に安定したヘアピン構造に折り畳ま室温オリゴヌクレオチドでアニールするようにNAMEアッセイを実行する方法を示しています。核酸の放射性標識は、要求された、とdetectiされていませんオリゴヌクレオチドバンドの上に、従来の染色法により行うことができる。組換え全長タンパク質またはNCの切断合成バージョンのどちらを採用してアッセイは、NC、RNAおよびDNAの強い結合と相関することが示される活性を阻害するスレッドインターカレーターの同定を可能にする。14

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="631">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:192px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:155px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified.</td>
			<td style="width:140px;">Metabion International AG</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock&#160; solution at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Metabion International AG</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock aliquot at -80 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">(12-55)NC peptide</td>
			<td style="width:140px;">EspiKem srl</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">0030 120 086</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">0.5 mL tubes</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">0030 121 023</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 0.1-10 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">701,130,210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 2-20 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">70,760,213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 200 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">70,760,213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Syringe Filter 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">Biosigma srl</td>
			<td style="width:145px;">51,798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Ethanol</td>
			<td style="width:140px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:145px;">414631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71725-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">D8418-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71376-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">B0252-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Magnesium Perchlorate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">222283-100G</td>
			<td style="width:155px;">Store the 1M solution at&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Glycerol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">49770-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:145px;">17-1329-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:192px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">T9281-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:192px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A7460-500G</td>
			<td style="width:155px;">Prepare the 10% solution freshly before use</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:192px;">Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1)</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:145px;">1006401000</td>
			<td style="width:155px;">Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Tris ultrapure</td>
			<td style="width:140px;">Applichem</td>
			<td style="width:145px;">A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">DEPC-treated water</td>
			<td style="width:140px;">Ambion</td>
			<td style="width:145px;">AM9922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">22,621,408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">NanoDrop 1000 spectrometer</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">UV-VIS spectrometer Lambda 20</td>
			<td style="width:140px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Protean II xi Cell</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:145px;">165-1803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:145px;">164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:192px;">SybrGreen II RNA Gel Staining</td>
			<td style="width:140px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">50523</td>
			<td style="width:155px;">Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4&#176;C for two weeks&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Geliance 600 Imaging System</td>
			<td style="width:140px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors

安定した三次元折りたたみで折り畳まRNAまたはDNAは、抗腫瘍または抗ウイルス薬の開発において興味深い標的である。 HIV-1の場合には、ウイルスの活動の調節に関与するウイルスタンパク質は、いくつかの核酸を認識する。ヌクレオカプシド蛋白NCp7（NC）は、ウイルス複製の間にいくつかのプロセスを調節する重要なタンパク質である。 NCは、実際にはRNAおよびDNA、それらのアニーリングを容易にする二次構造を不安定化するシャペロンである。 NCの不活性化は、新しいアプローチおよび抗HIV療法のための興味深い標的である。 Nは nnealing- MがEの lectrophoresis ediated ucleocapsid（NAME）アッセイにより、そのようなTARのヘアピン構造およびHIVのCTAR要素として熱力学的に安定な三次元コンホメーションに折り畳まれたRNAおよびDNAの融解およびアニーリングを阻害することができる分子を同定するために開発されたHIV-1のヌクレオキャプシドタンパク質。新しいアッセイは、再いずれかを採用以前の標識を必要とせずcombinantまたは合成タンパク質、およびオリゴヌクレオチド。結果の分析は、従来の核酸の染色に続いて、標準的なポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって達成される。この作品で報告されたプロトコルは、核酸シャペロンの両方有能な、全長タンパク質または基本的なN末端ドメインを欠くその切断型と名前がアッセイを実行する方法について説明し、どのようにすることによって、NCのシャペロン活性の阻害を評価するためにインターカレースレッディング。また、NAMEは、識別NC阻害剤の作用の推定機構に関する指標を得るために、2つの異なるモードで便利に行うことができる。

図1は、ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイの代表的な結果を示し、iは 、全長の組換えタンパク質、ii）のタンパク質を含まない、 すなわち CTAR + TARを混合し、RTで1時間までインキュベートすること、 および iiiで）行う）（12-55）NC、N末端 ​​ドメインの11アミノ酸を欠く合成ペプチドを用いて行っ同じアッセイ。予め折り畳まれたTARとCTARを混合し、アニールしたヘテロTAR / CTARの形成はタンパク質の非存在下で、全長組換えNC（ 図1の左側のレーン）の存在下でモニターした（ 図1の中央のレーン）、および短縮型（12-55）NCペプチド（ 図1の右側のレーン）の存在下で行われる。コントロールは、次のとおりです。彼らの遅いannealin続いCTARにTARの安定に折り畳まれた構造体の熱変性して得られた、CTAR、折り畳まれたTAR、およびアニールしたハイブリッド（TAR / CTAR）を折り畳んグラム。14 拡張されたヘテロ二重らせんに二つの安定核酸配列を変性させるNCの能力は明らかである：フルレングスNCタンパク質は、TAR / CTARハイブリッドの形成にすぐにつながる：0 &#39;NCへの追加の間を通過する最小限の時間を示しサンプルと反応を停止ゲルローディング緩衝液の添加;完全な形成がすでに15分間のインキュベーション時間の後に達成される。アニールヘテロ強度の増加は、折り畳まれたCTARとTARオリゴヌクレオチドの強度の減少に匹敵する。ヘテロ二本鎖形成は切断型の存在下でも達成され、合成ペプチドの生物学的活性を確認する、（12-55）NC、すなわち 。蛋白質またはペプチドの非存在下でヘテロ形成が観察されず、TARとCTARオリゴヌクレオチドは、ヘテロ（ 図1）に、室温でアニールしない。ですべての実験、不安定な中間体の速い形成時間をかけて減少する（ 図1の「中間複合体」）は、一貫して正確な核酸は折りたたみまでCTARとTARのヘアピンを通して鎖交換の提案されたメカニズムで、観察される。17 実験の可能性のトラブルシューティングは、ゲルローディング緩衝液中のSDSの欠如である。 GLBにおけるSDSの非存在下での反応の結果を図2に示し、GLB + SDSによる結果と比較される。予め折り畳まれたTARとCTARを混合し、組換え完全長NC蛋白質と37°Cで3時間の室温で3時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを2つに分割した。SDSなしの半分ゲルローディングバッファー（GLB）の他の半分にGLBは、SDS（GLB SDS）であったが、添加した。サンプルをゲル上にロードし、そしてゲルによって実行後に​​核酸バンドの位置を可視化した色素染色。これが予想され、タンパク質と核酸との間の強い結合を示します。NCは存在していたが、サンプルはGLBをロードしたときは、全ての核酸バンドがシフトアップされた。 GLB SDSとの結果がゲルの一番右に示されている：SDSの追加は、コントロールと比較を可能に、タンパク質を変性し、タンパク質と安定な複合体から核酸を放出する。 NAMEアッセイは動的核酸構造を安定化し、NCのシャペロン活性を阻害するためにインターカレー転位する能力を評価するために使用される。14スレッディングインターカレーターは、例えば、アントラキノン環系の反対側の部位に位置する大きな側鎖によって置換された平面状の芳香族分子である図3Aに示されている。18これらのインターカレーターは、核酸の二重らせんを縫うすることができ、最終的に二重の溝に、それらの側鎖の位置をらせん。19,20 図3Bは、化合物1の存在下でNAMEアッセイの結果を示し、既知のスレッディングインターカレーター、完全長のNCまたは切断ペプチドの存在下で18。両方の場合において、NCによってTAR / CTARハイブリッドの形成は、一方、同時に、フリーTARとCTARの量が増加するとインターカレーターの濃度を増加させることによって低減される。 N末端尾部（12-55NC）を欠くタンパク質の切断型は、その活性の阻害に対してより敏感である。この差は、これまでに試験された全ての化合物を用いて検証した。 NAMEアッセイは、折り畳まれたオリゴヌクレオチド（NC-プレインキュベーションモード）を添加したNCとプレインキュベートする試験化合物による、9893核酸基質との15分間の試験化合物をプレインキュベートすることによってのいずれか2つの方法で行うことができる、NCおよび15分間のさらなるインキュベーション（オリゴ広報し、続いてeincubationモード）。全体的なインキュベーション時間は、二つの異なるモードで同じであるが、NCの添加前に折り畳まれたオリゴヌクレオチドを​​用いたプレインキュベーションは、折り畳まれた核酸へのインターカレーターのスレッドのためのより多くの時間を可能にする。これは彼らのダイナミックな構造の強い安定化とNCシャペロン活動をより容易に抑制に結果。 図4に示すように、2つのモードでNAMEアッセイの解析は、したがって、NC阻害剤の作用機序の違いを増強する：化合物1は、オリゴプレインキュベーションモードでNAMEによって分析したとき（ 図4、左のレーン）はるかに低い阻害はNC-プレインキュベーションモードで観察されるのに対し、それは、NC媒介アニーリングの強力な阻害を示す（ 図4、右のレーン）。このアッセイで、これらの条件に関連化合物のセットをスクリーニングしながら、阻害濃度の測定のために各experiていることに注意してくださいメントは、 図14（特にIC 50値の周り）狭い間隔の濃度を用いて、少なくとも三連で実施されなければならない<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> 図1：フルレングスNC付きと切り捨て（12から55）NCつ折りTARとCTAR、それぞれ1μM とNAMEアッセイは 、組換えNCまたはでインキュベートした（12から55）NC（オリゴ/ NC = 1 / 8）0分、15分、30分および1時間。タンパク質（0分、15分、30分、1時間）の非存在下でインキュベートしたTARとCTARを陰性対照として使用した。折り畳まれたTAR、折り畳まれたCTARハイブリッドTARは/ CTARはインビトロアニーリング対照として使用した、続いて熱変性した後に得られる。反応はその後GLB SDSを使用して停止した。サンプルは、1×TBE中で12％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後のゲル上の核酸は、染色し、イルミ上で検出された。 <html><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> 図2：ゲルローディングバッファー中のSDSの影響（GLB）TNMG 1X ​​に予め折り畳んだNC TARとCTAR によるTAR / CTARアニールを 、 分析するときに 、3のために全長組換えNC（オリゴ/ NC = 1/8）と共にインキュベートした。室温または37℃で時間。 GLBまたはGLB SDSその後、NCとインキュベートした試料に添加した。コントロール：TAR、CTARアニールハイブリッドTAR / CTAR（各1μM）。電気泳動は1×TBE中で12％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。電気泳動後のゲル上の核酸は、染色し、イルミ上で検出された。 。この図は、図S4から変更されている：。Sosic、A. らの設計、合成およびHIV-1ヌクレオカプシド阻害剤としてTARとCTARバインダーの生物学的評価MedChemComm 4、1388年から1393年、DOI：10.1039 / c3md00212h（2013） 。 &quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> 図3：NAMEアッセイによって評価インターカレー1スレッディングのスレッディングインターカレーター1.（B）の（A）化学構造の影響。折り畳まれたTARとCTAR、それぞれ1μMは、完全長のNCまたは（12-55）NC、それぞれ8μMを有する化合物1の示された濃度の存在下でインキュベートした。 CTARと拡張ヘテロTAR折り畳まつ折りTARは、/ CTARを対照として使用した。反応はその後GLB SDSを使用して停止した。サンプルは、1×TBE中で12％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後のゲル上の核酸は、染色し、イルミ上で検出された。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> 図4：NC-プレインキュベーションモードに対するオリゴプレインキュベーション：NAME検定への影響 オリゴプレインキュベーションMOD。E：、TARを折り畳まれ、各1μMをCTARを折り畳まれた完全長のNC（8μM）の存在下で15分間スレッディングインターカレーター1の示された濃度でプレインキュベートした後、さらに15分間たNC-プレインキュベーション 。 モード ：スレッドインターカレー1の示された濃度は、それぞれ1μM、15分間、完全長NC（8μM）と共にプレインキュベートし、次いで、さらに15分間、折り畳まれたTARの存在下でCTAR折り畳まれた。 CTARと拡張ヘテロTAR折り畳まつ折りTARは、/ CTARを対照として使用した。すべての反応は、最終的にGLB SDSを使用して停止した。サンプルは、1×TBE中で12％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後のゲル上の核酸は、染色し、イルミ上で検出された。

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Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

nucleocapsid-annealing-mediated-electrophoresis-name-assay-allows

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

8.8K ビュー.  University of Padova. This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

免疫・感染学

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

標準的な臨床アッセイによる検出限界以下のウイルス量とHIV感染個体におけるHIV - 1 RNAを増幅して定量化

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...