このプロトコルを使用して、重水素酸化物、またはD2O、水の非放射性、安定同位体、体組成および水消費量を推定するために使用することができる。この技術は非侵襲的であり、したがって絶滅危惧種、ならびにヒトおよび家畜種における体組成を評価するために使用することができる。重水素酸化物希釈技術のユニークなアプリケーションは、高い奪還率または社会的に収容された動物の自由範囲の野生生物の水消費量を測定する能力です。
麻酔は必要ないが、重水素酸化物を送達する前に動物を鎮静させるために皮下注射を与えることに精通していない人にとっては簡単かもしれない。サラ・フーパーと私と一緒に手順をデモンストレーションするのは、アマンダ・エシェルマンとアシュリー・コーワン、獣医学生、そして私の研究室の大学院生であるアリシア・ロイスタチャーです。1リットル当たり9グラムの50ミリリットルのストック溶液を塩分化した重水素酸化物を作るために、最初に450ミリグラムの医薬グレードの塩化ナトリウムを量り、正確な量を小数点以下4桁に記録する。
すべての塩を殺菌した100ミリリットルビーカーに移し、滅菌された段階的なシリンダーで99.8%以上の重水素酸化物の50グラムを測定します。重水素酸化物の正確な量を小数点以下4桁に記録し、重水素酸化物を塩化ナトリウムの滅菌ビーカーに移します。次に、10ミリリットルのシリンジバレルを取り付けたサブミクロン孔を備えた非発熱性の無菌ディスクフィルターに20ゲージの針を取り付け、無菌、空、100ミリリットルバイアルの中隔に針を挿入します。
真空管を22ゲージの針に取り付け、針を100ミリリットルバイアルの中隔に挿入します。その後、10ミリリットルのイソスモティック強度の塩化ナトリウムをシリンジバレルにロードし、重水素酸化物溶液がゆっくりとバイアルにろ過し始めるまでゆっくりと真空をオンにします。50ミリリットルの体積全体がろ過されるまで、重水素酸化物ストック溶液をシリンジバレルに注ぎ続けます。
麻酔下のコウモリのつまみつまみへの応答の欠如を確認した後、アルコール準備パッドを使用して大腿静脈の上にウロパタギウムをきれいにし、乾燥させた乾燥した尾膜を可能にする。石油ゼリーの薄い層を大腿静脈の上に塗布し、29ゲージの針を使用して、大腿静脈の背部部分を穿刺します。その後、100マイクロリットルの血液を収集するためにプラスチックナトリウムヘパリン毛細管を使用してください。
全血とヘパリンナトリウムの適切な混合を確実にするために、標識する前に採血後に各チューブをそっと転がす。注入するグラム中の重水素酸化物の質量を決定した後、重水素酸化物の適切な量を有する29ゲージ針を装備したインスリン注射器をロードする。重水素を装填したインスリン注射器と針の重量を秤量し、体重を小数点以下4位に記録し、麻酔付きコウモリの後部股関節領域の上に皮下に重水素酸化物の全容を注入する。
帯電防止ドラフトシールドを備えた精密スケールを使用し、注入前に負圧を確保するためにプランジャーを引き戻すことをお勧めします。注射直後に、現在空のインスリン注射器と針の重量を量り、小数点以下4桁に体重を記録する。血液採取後30分以内に、ヘマトクリット遠心分離機を使用して、各毛細管を10,000回gで5分間回転させます。
鋭利なはさみを使用して、全血と血漿の間のプラスチック毛細管チューブを切断し、200マイクロリットルのピペットを使用して、プラズマを標識された500マイクロリットル貯蔵チューブに直接排出します。平衡期間の後、ちょうど示したように、大腿静脈から別の100マイクロリットルの血液を収集して保存する。FTIR分光光度法解析では、蒸留を容易にするために砂浴の温度を摂氏60度に設定し、各プラズマサンプルと標準の50マイクロリットルを個々の1.5ミリリットルの円錐形のマイクロ遠心分離キャップに加えます。
マイクロ遠心分離機のキャップを逆さまに保ち、1.5ミリリットルの円錐型マイクロ遠心分離チューブをキャップにねじ込み、反転チューブを砂風呂に接触させ、最低12時間置きます。翌朝、新しい清潔なキャップを各チューブに置き、マイクロ遠心分離機でマイクロ遠心分離管を10秒間パルスします。液体透過セルをFTIR分光計に取り付け、メタノールでセルを充填します。
注入口を接続し、気泡の危険を減らすために慎重にメタノールシリンジを除去しながら、バックグラウンド水でセルをゆっくりと満たします。サンプルの後分析を取り外しできるように、出力ポートにチューブを取り付け、FTIR分光器ソフトウェアを開きます。テーブルに従ってパラメータを設定し、希釈剤、0.22マイクロメートルのろ過水を使用してバックグラウンドサンプルを収集し、蒸留水。
100万個の重水素酸化物標準ごとにゼロ部品の40マイクロリットルを注入し、カンマ区切り値ファイルとしてスペクトルを記録して保存します。標準曲線を作成するためにすべての標準のスペクトルを注入して保存した後、液体透過セルに各蒸留サンプルの40マイクロリットルを注入し、スペクトルを保存します。既知の平衡時間では、野生に捕まった大きな茶色のコウモリと捕虜の大きな茶色のコウモリのための総体水、無駄のない体重、体脂肪量を決定することができます。
負の体脂肪量は、重水素酸化物の全用量を受け取らない、平衡期に魚雷になる、異常に大きな脂肪塊と最小限の無駄のない質量を有する、またはデュアルX線吸収法によって決定される3〜5%以下の体脂肪を有する:以下の理由の1つ以上のために計算することができる。ここで、重水素酸化物希釈法と比較して重いX線吸収法によって求められる体脂肪の代表割合が示されている。2つの技術はよく相関しており、体脂肪量は体脂肪と体重の間に強い相関関係を示し、重水素酸化物希釈技術は一貫して体脂肪量を超えたり過小評価したりしていない。
重水素酸化物希釈法は、以前に猫で検証されており、実験の各食餌ブロックの間に社会的に収容された猫の毎日の水消費量の測定を可能にするためにこの技術が適応されました。この技術は健康な動物に対してのみ実行されるべきであり、各動物に重さ、記録し、重水素酸化物の全用量を正確に提供する必要があることを覚えておいてください。完全なカルカス分析やDEXAなどの体組成を決定するための二次的な方法を、重水素酸化物技術を検証するために完了することができる。
この技術により、各猫を分離せずに異常に大量の水を消費していた社会的に収容された猫を特定して水の消費量を測定することができました。
