Name: mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
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私たちは、原稿の準備と彼のサポートと支援のための博士ロジャーエリクソンに感謝します。 この作品は、 国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされていました （認可番号RO1CA177984; RO1CA138642）、前立腺癌（BX001604）のVAプログラムプロジェクト。

ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）または新鮮な凍結前立腺癌試料はSFVAMCから得ました。サンプルはSFVAMCで根治的前立腺切除術を受けた前立腺癌患者からのものでした。書面によるインフォームドコンセントがすべての患者から得られたものであり、研究はヒト研究に関するUCSF委員会により承認されました。代替的に、前立腺癌組織マイクロアレイは、商業的供給源から入手し、miRNAはISHによって分析のために使用しました。分析前立腺癌患者のための臨床病理学的およびフォローアップ情報を収集しました。 1.組織サンプル<ol><li>製造業者のプロトコルに従ってH＆Eとのミクロトームや染色を用いて10μmの切片に前立腺癌組織サンプルをカットします。 </li><li>前立腺がん病巣の同定のための染色スライドだけでなく、隣接する正常な腺上皮を確認します。 注意：ボード認定病理医は、H＆E染色スライドとミリアンペアを確認する必要があります腫瘍および正常領域に対するRK。 miRNAのための後続のセクションのガイドが通常のエリア対腫瘍から分析するとマークされたスライドを使用してください。 </li></ol>定量的リアルタイムPCRによる2 miRNA発現解析注意：レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、（miRNAおよびmRNAを含む）全RNAを単離し、次のセクションで説明するようにTaqMan（登録商標）マイクロRNA発現アッセイを用いて、成熟miRNAのアッセイ：このワークフローは、以下の工程を含みます。 <ol><li> RNA抽出<ol><li>前立腺癌FFPE組織からのmiRNAの単離<ol><li>レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM） 注：化学ヒュームフードの手順2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4を実行します。 <ol><li> LCMのための組織スライド（10μmのセクション）を準備します。 10分ごとに、（2×）キシレンに浸してDeparrafinize組織切片を、蒸留に続く段階的エタノール（100％、95％、90％、80％、70％）で各5分間、スライドをインキュベートすることにより組織を再水和水（5分）。 </li><li>再水和後、30秒間ヘマトキシリン​​で染色のセクションでは、続いて水。 </li><li>段階的なエタノール（70％、95％、90％、80％、70％）（各5分）およびキシレン（5分）に入れ組織。 </li><li>その後、ドライヒュームフード内スライドとは、顕微解剖用のLCM器に置きます。 </li><li>製造元の指示24に従ってLCMシステムとmicrodissectionsを実行します。病理医が前立腺がん病巣だけでなく、隣接する正常組織の同定のためのガイドとしてスライドをマークアップされた使用します。 70〜90ミリワットの電力で10〜20ミクロンの直径のパルスのレーザービームを使用してください。 </li><li> LCMキャップ上に赤外線レーザーパルスで関心領域をキャプチャします。サンプルあたりのmiRNA抽出に2-5キャップから細胞を組み合わせます。抽出したRNAの完全性を確保するために、すぐにmiRNAの抽出のために捕獲された細胞を処理します。 </li><li>代替的に、miRNAの抽出緩衝液中の溶解細胞（メーカーのプロトコールに従って）およびSTO-80ºCで溶解物の再。 </li></ol></li><li> LCMマイクロダイセクション組織からのmiRNA抽出と分析<ol><li>製造者の指示に従って市販のキットを使用して、顕微解剖FFPE組織から全RNAを抽出します。 注：レーザーキャプチャーmiscrodissectionからのRNAの収量は、典型的には低いです。したがって、RNAは、少量（20〜30μL）中に溶出し、製造業者の指示に従ってタックマンマイクロRNA発現アッセイを用いた発現プロファイリング（また、セクション2.2に記載されている）のために使用されます。成熟miRNAのリアルタイムPCR検出のための入力RNAの最適化は、溶出されたRNAの5マイクロリットルを各miRNA特異的逆転写反応のために最適であることを示唆しています。内因性の対照として、RNU48 / RNU24が使用されます。コントロール反応のために、溶出されたRNAの2μlの逆転写反応に使用されます。 </li></ol></li></ol></li><li>前立腺癌凍結組織からのmiRNAの単離<ol><li> Homoge乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で組織を粉砕することにより凍結切除した前立腺組織をnize。冷却されたスパチュラを用いてマイクロチューブにホモジナイズした組織を転送します。組織は簡単に転送することができるように均質化し、液体窒素中に浸漬することにより、同じ温度で、乳鉢/乳棒とへらを維持します。 </li><li>ホモジナイズした組織に商業グアニジンイソチオシアネート - フェノール試薬（組織を1ml / 0.1 g）を加え、室温で5分間インキュベートします。 注：商業グアニジンイソチオシアネート - フェノール試薬中でホモジナイズした組織は、数ヶ月間-80ºCで保存することができます。 </li><li>ホモジネート（0.2ミリリットルのクロロホルム/ mlの）にクロロホルムを加え、30秒間激しく振ります。 4ºCで20分間10,000×gで遠心分離し、3〜5分間、室温でサンプルをインキュベートします。 </li><li>新しい滅菌RNaseフリー1.5mlチューブに上部の水相を転送します。 </li><li>イソプロピルアルコールを等量加えます。 10マイルのために混合し、インキュベートnはRTでRNAをペレットに4ºCで20分間12,000×gで遠心分離しました。 </li><li>上清を吸引し、70％エタノール1mLでRNAペレットを洗浄します。 4ºCで10分間12,000×gで遠心分離します。 </li><li>慎重に上清を吸引。 5〜10分間室温で乾燥RNAペレット。 50〜100μlのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶解します。 </li><li>ナノドロップ分光光度計を用いてRNAの定量化を行い、バイオアナライザーとRNAの完全性を決定します。 10 NG /μlにRNA濃度を調整します。 PCR分析リアルタイム（2.2節）に続いてmiRNA-特異的cDNA反応のために10〜50 ngのRNAを使用してください。 </li></ol></li></ol></li><li> miRNA発現解析のための定量的リアルタイムPCR 注：以下に記載されるように、二段階RT-PCRプロトコルを用いて成熟miRNAをアッセイ。 <ol><li>逆転写（RT） <ol><li>製造者の指示に従い、miRNAの逆転写キットを用いてRNAからcDNAを逆転写。マイクロRNAアッセイおよびRTキットからのmiRNA特異的プライマーを用いて全RNAの10〜50 ngのを使用してください。コントロールとしてRNU48 / RNU24 / RNU6Bを使用してください。 （分析miRNAの豊富さに応じて）1:10 5次のステップで説明するように、リアルタイムPCR検出に使用します。cDNAの1を希釈します。 </li></ol></li><li>成熟miRNAの検出のためのリアルタイムPCR <ol><li>製造者の指示に従い、高速ユニバーサルマスターミックスを用いてマイクロRNAアッセイを用いてcDNA試料からPCR産物を増幅します。 RNU48 / RNU24 / RNU6Bコントロールにサンプルを正規化します。高速リアルタイムPCRシステム上の遺伝子発現の相対的変化を計算するために、比較Ct（閾値サイクル）メソッドを使用します。三連で各サンプルを分析します。 </li></ol></li></ol></li></ol> in situハイブリダイゼーション （ISH） では 3. miRNA発現解析<ol><li>組織の前処理<ol><li>ミクロトームを用いてFFPE前立腺癌組織ブロックから5μmの切片をカットします。 </li><li&gt;は1時間56℃でスライドをインキュベートすることにより、組織切片を固定してください。 注：スライドは、miRNA分析のために数週間室温で保存することができます。 </li><li> 15分ごとに、キシレン（2×）でスライドを浸すことによって、組織をDeparrafinize。 </li><li>蒸留水（5分間）、続いて段階的なエタノール（100％（2倍）、95％、90％、80％、70％）中で5分間ずつスライドをインキュベートすることにより組織を再水和します。 </li><li>室温で20分間PBS中の4％パラホルムアルデヒドでスライドを修正しました。 </li><li>それぞれ5分間、室温でPBS（2×）でスライドを洗浄します。 </li><li>予熱したプロテイナーゼKバッファー中で10分間（5 mMのトリス塩酸pH7.4の、1mMのEDTA、1 mMのNaCl）で、37ºCで10 / mlのプロテ​​イナーゼKでスライドを扱います。 </li><li>プロテイナーゼK処理後、30秒間、PBS中0.2％グリシンを有するスライドをすすぎます。 </li><li> 5分間室温でPBS（1×）でスライドを洗浄します。 </li><li> 15分間PBS中の4％パラホルムアルデヒドでスライドを修正しました。 </li><li>スライドをすすぎで5分間、PBS。 </li></ol></li><li>ハイブリダイゼーション<ol><li>加湿チャンバー内55ºCで3〜4時間、プレハイブリダイゼーション溶液でスライドをプレハイブリダイズします。加湿チャンバーを維持するために、50％ホルムアミド/ 50％5×SSCに浸した組織ラボワイプを使用してください。 </li><li>ハイブリダイゼーション緩衝液中の20〜50 nMの濃度で5 &#39;ジゴキシゲニン標識プローブを使用してください。 、miRNA特異的プローブ（20〜50 nM）を、小さな核RNA U6コントロールプローブ（20 nM）を希釈して4分間90ºCでの熱、氷の上に置き、冷ハイブリダイゼーション緩衝液（2-4 NG /μLを氷に追加）。 </li><li>プローブ特異的ハイブリダイゼーション温度で12〜16時間インキュベート、ハイブリダイゼーション溶液（プローブ+ハイブリダイゼーション緩衝液、スライドあたり100μl）を追加し、プレハイブリダイゼーション溶液を除去（ハイブリダイゼーション温度= Tmのプローブ-21ºC）。加湿チャンバー（50％ホルムアミド/ 50％5×SSC）でハイブリダイゼーションを行います。 </li></ol></li><li>洗浄工程<ol><li> 45ºCで10分間の2×SSCでスライドを洗浄します。 </li><li>ウォッシュトン彼は45ºCで10分間1.5×SSCでスライドします。 </li><li> 20分ごとに37ºCで0.2×SSCの（2×）でスライドを洗浄します。 </li><li>室温で1〜2時間、1×ブロッキング溶液でスライドをインキュベート</li></ol></li><li>発見<ol><li> 1でスライドをインキュベート：100 PBSを1-4時間、または一晩、4ºCでAP結合抗ジゴキシゲニン抗体を希釈しました。 </li><li> 10分ごとに、室温でPBS（3×）でスライドを洗浄します。 </li><li> 5分ごとに室温でアルカリホスファターゼバッファー（100 mMトリスpHは9.5、50のMgCl 2、100mMのNaCl、0.1％のTween-20）とスライド（2×）で洗浄します。 </li><li> 1-20時間室温で暗所でのBMパープルAP基質でスライドをインキュベートします。 </li><li> PBSは、水中0.1％のTween-20および洗浄（2回）を含むでスライドを洗浄します。 </li><li>メディアのマウント水溶液を使用してスライドをマウントし、顕微鏡で調べます。 </li></ol></li></ol>

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The authors have no financial disclosures.

本稿では、アーカイブされたFFPEまたは新鮮凍結前立腺癌臨床組織中のmiRNA発現プロファイリングのための単純化されたワークフローについて説明します。前立腺癌では、いくつかの研究は、前立腺癌の開始、進行および転移におけるマイクロRNAの重要な役割を示唆しています。しかし、矛盾する結果は、多くの場合、miRNAを抽出するので、特定のmiRNA 22で得られると方法は広く異なっ?...

前立腺がんは男性の癌関連死亡率の主要な原因の一つである一般的に診断男性悪性腫瘍です。米国では、推定220800新たな症例と27540人の死亡は2015年1に報告されます。 前立腺癌は、腫瘍が無痛または非常に積極的であることができcourse-非常に可変性疾患を有する不均質な疾患です。前立腺癌の臨床管理における重要な課題は、疾患のスクリーニング、診断、予後および治療​​2のために現在使用されている方法/バイオマーカーの不足によってもたらされています。現在のスクリーニング方法は、前立腺生検3に続く前立腺特異抗原（PSA）試験及び直腸指診（DRE）が挙げられます。前立腺特異抗原（PSA）は、有意に臨床管理及び改善された生存率4に革命をもたらした最も広く使用されている前立腺癌のバイオマーカーです。しかし、LACを含むPSAの固有の制限のために特異性、PSAに基づくスクリーニングのkは診断の上、および疾患の治療の上につながっています。このビューでは、集中的な取り組みは、特に疾患の攻撃を予測し、より良い治療法の決定に4,5を駆動することができる、別の前立腺癌バイオマーカーの探索に向けられています。過去数年にわたり、マイクロRNA（miRNA）は、有望な代替前立腺癌バイオマーカーとして浮上しています。 マイクロRNA（miRNA）は、同族のmRNA標的の3 &#39;非翻訳領域（UTR）との配列特異的相互作用を介して転写後の遺伝子発現を抑制する小さな非コードRNAの進化的に保存されたクラスを構成します。これは、mRNAの&gt; 60％が6のmiRNAの標的を保存していると推定されます。 miRNA遺伝子は、遺伝子間領域内またはタンパク質/非タンパク質コード遺伝子のイントロン7またはエクソン内に位置しています。これらの遺伝子は優先的プリマに、RNAポリメラーゼIIによって転写されますヘアピン状のステムループ二次構造を形成RYのmiRNA（数キロベースの長いPRI-miRNAは、）。これらのpri-miRNAは、細胞質に輸送し、さらに成熟miRNA（18〜25ヌクレオチド長）8-10に加工された前駆体のmiRNA（プレmiRNAは、60〜75ヌクレオチド長）に加工されています。 miRNAは、増殖、発生、分化およびアポトーシスを11などの主要な細胞プロセスを調節します。研究では、前立腺癌12-15を含む種々のヒト悪性腫瘍におけるmiRNA発現プロファイルの広範な調節不全を示唆しています。 miRNA発現プロファイルは、広く原発性および転移性前立腺癌において異常調節されることが報告されています。改変されたmiRNAの発現は、前立腺癌の進行、攻撃性とのmiRNA 12,14,16-19の予後の可能性を強調再発とリンクされています。証拠の成長体は、miRNAが、前立腺癌の発生、発達、進行中の重要な機構的な役割を果たしていることを示していますイオンおよび転移。全体的に、miRNAは、前立腺腫瘍12の層別化に正常組織および癌組織と援助とを区別することができる前立腺癌の診断および予後のための有望な代替のバイオマーカーを浮上しています。また、miRNAは、前立腺癌20に対する有効な治療薬の開発のための重要な標的です。 その小さなサイズと、内因性RNase活性に対する抵抗性のために、miRNAは、容易に、ホルマリン固定組織21及び22の前立腺生検で検出することができる安定したバイオマーカーです。さらに、miRNAの発現プロファイルは、凍結およびホルマリン固定組織で比較されており、21強く相関することが見出されています。しかし、前立腺癌臨床組織においてmiRNA発現プロファイリングはしばしば重くRELI前立腺癌のための有効なバイオマーカーとしてなど、エラーをサンプリングする、腫瘍の不均一性に起因するmiRNAの開発を間質汚染を挑戦され臨床組織における自分の正確な検出にES。ここでは、アーカイブFFPEまたは新鮮凍結前立腺癌臨床検体でmiRNA発現プロファイリングのための私たちの研究室で使用される単純化されたワークフローについて説明します。我々は、定量的リアルタイムPCRの組み合わせを採用したmiRNAのためのin situハイブリダイゼーション旧得、より定量的な情報および組織の配列に潜在的なmiRNAバイオマーカーの発現差異を可視化するため、後者で、臨床検体の分析。このワークフローの中で、私たちはFFPE、凍結前立腺組織からのmiRNA抽出のための既存の方法論を最適化し、式はロックされた核酸（LNA）を用いたin situ ハイブリダイゼーション技術でのTaqmanプローブベースのmiRNA RT-PCRおよびmiRNAの分析により、プローブ23をベース。 LNAベースのプローブは、DNAまたはRNA-ベースのプローブと比較して増加した感度と特異性を提供し、すべてのmiRNA配列のロバストな検出を可能に関係なく、GC含量のもdiscriminaを許可miRNAファミリーのる。我々の最適化されたmiRNAのISHプロトコールは、miRNAバイオマーカーの発見を加速する可能性を提供し、後者で、前立腺癌組織スライドまたは前立腺癌組織マイクロアレイ（TMA）に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems&amp;nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix for LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast Real-time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>DIG labeled LNA probe for U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP substrate</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Pre-hybridization solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-2&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-8&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>AP-conjugated anti-digoxigenin antibody</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-7&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Aqueous mounting media&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>H-5501&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018&quot;&gt;15596-018&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&amp;nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues

前立腺癌（PCA）臨床管理における重要な課題は、疾患のスクリーニング、診断、予後および治療のために現在使用されているバイオマーカーの不足によってもたらされています。近年では、マイクロRNA（miRNA）は、前立腺癌の診断および予後のための有望な代替バイオマーカーを浮上しています。しかし、前立腺癌のための有効なバイオマーカーとしてのmiRNAの開発が重く、臨床組織におけるそれらの正確な検出に依存しています。 miRNAは、多くの場合、腫瘍の不均一性、サンプリングエラー、間質汚染などのmiRNAは、組み合わせのを使用して、アーカイブFFPEや新鮮凍結前立腺癌臨床検体で分析するために、この記事の目的は、単純化されたワークフローを記述することであるために挑戦された前立腺癌臨床検体で分析します定量的リアルタイムPCR（RT-PCR）、およびインサイチュハイブリダイゼーション （ISH）。このワークフローの中で、私たちは、FFPEからのmiRNA抽出のための既存の方法論や凍結前立腺TISSUを最適化ESおよび発現は、タックマン・プローブベースのmiRNA RT-PCRにより分析します。ベースのプローブ - 加えて、我々は、ISHのための最適化された方法は、ロックされた核酸（LNA）を使用して、前立腺組織においてformiRNA検出を分析記述する。我々の最適化されたmiRNAのISHプロトコールは、前立腺癌組織スライドまたは前立腺癌組織マイクロアレイ（TMA）に適用することができます。

RT-PCRによってLCM原発性前立腺癌臨床検体におけるmiR-203の発現プロファイリング分析（図1） RT-PCRは、LCM原発性前立腺癌組織中のmiR-203の相対的発現の分析及びコントロールとして使用したSAINI ら RNU48 15で説明したようにマッチした隣接する正常領域を行いました。以下の表は、隣接する正常組織に比べて前立腺癌腫瘍組織における相対的なのmi...

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miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K ビュー.  University of California San Francisco. Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

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MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

医学

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results in cancer regression. However, in a significant number of cases, the disease progresses to advanced, castration-resistant prostate cancer (CRPC), which has limited therapeutic options and is often aggressive. Distant metastasis is mostly observed at this stage of the aggressive disease. CRPC is treated by a second generation of AR pathway inhibitors that improve survival initially, followed by the emergence of therapy resistance. Neuroendocrine prostate cancer (NEPC) is a rare variant of prostate cancer (PCa) that often develops as a result of therapy resistance via a transdifferentiation process known as neuroendocrine differentiation (NED), wherein PCa cells undergo a lineage switch from adenocarcinomas and show increased expression of neuroendocrine (NE) lineage markers. In addition to the genomic alterations that drive the progression and transdifferentiation to NEPC, epigenetic factors and microenvironmental cues are considered essential players in driving disease progression. This manuscript provides a detailed protocol to identify the epigenetic drivers (i.e., small non-coding RNAs) that are associated with advanced PCa. Using purified microRNAs from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) metastatic tissues and corresponding serum-derived extracellular vesicles (EVs), the protocol describes how to prepare libraries with appropriate quality control for sequencing microRNAs from these sample sources. Isolating RNA from both FFPE and EVs is often challenging because most of it is either degraded or is limited in quantity. This protocol will elaborate on different methods to optimize the RNA inputs and cDNA libraries to yield most specific reads and high-quality data upon sequencing.

Therapy resistance often develops in patients with advanced prostate cancer, and in some cases, cancer progresses to a lethal subtype called neuroendocrine prostate cancer. Assessing the small non-coding RNA-mediated molecular changes that facilitate this transition would allow better disease stratification and identification of causal mechanisms that lead to development of neuroendocrine prostate cancer.

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

がん研究

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

TMEM200A:胃がんにおけるEMTおよびPI3K/AKTを調節する新規がん遺伝子

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in common cancers by multiomics analysis and used in vitro cell cultures of gastric cells to verify the results. The expression of TMEM200A in several human cancer types was assessed using the RNA-seq data from the UCSC Xena database. Bioinformatic analysis revealed a potential role of TMEM200A as a diagnostic and prognostic biomarker. 
Cultures of normal gastric and cancer cell lines were grown and TMEM200A was knocked down. The expression levels of TMEM200A were measured by using quantitative real-time polymerase chain reaction and western blotting. In vitro loss-of-function studies were then used to determine the roles of TMEM200A in the malignant behavior and tumor formation of gastric cancer (GC) cells. Western blots were used to assess the effect of the knockdown on epithelial-mesenchymal transition (EMT) and PI3K/AKT signaling pathway in GC. Bioinformatic analysis showed that TMEM200A was expressed at high levels in GC. 
The proliferation of GC cells was inhibited by TMEM200A knockdown, which also decreased vimentin, N-cadherin, and Snai proteins, and inhibited AKT phosphorylation. The PI3K/AKT signaling pathway also appeared to be involved in TMEM200A-mediated regulation of GC development. The results presented here suggest that TMEM200A regulates the tumor microenvironment by affecting the EMT. TMEM200A may also affect EMT through PI3K/AKT signaling, thus influencing the tumor microenvironment. Therefore, in pan-cancers, especially GC, TMEM200A may be a potential biomarker and oncogene.

著者スポットライト:胃がんにおける膜貫通タンパク質ファミリー関連マーカーの発表と標的療法への影響 

Here, a protocol is presented in which multiple bioinformatic tools are combined to study the biological functions of TMEM200A in cancer. In addition, we also experimentally validate the bioinformatics predictions.

汎がんバイオマーカーとしての TMEM200A のマルチオミクス解析

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

乳房癌のアーカイブ材料を用いた多重 RNA に基づく発現アッセイの最適化

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

生物工学

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

要約

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定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

汎がんバイオマーカーとしての TMEM200A のマルチオミクス解析

汎がんバイオマーカーとしての TMEM200A のマルチオミクス解析

汎がんバイオマーカーとしての TMEM200A のマルチオミクス解析

乳房癌のアーカイブ材料を用いた多重 RNA に基づく発現アッセイの最適化

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション