私たちは、原稿の準備と彼のサポートと支援のための博士ロジャーエリクソンに感謝します。 この作品は、 国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされていました （認可番号RO1CA177984; RO1CA138642）、前立腺癌（BX001604）のVAプログラムプロジェクト。

ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）または新鮮な凍結前立腺癌試料はSFVAMCから得ました。サンプルはSFVAMCで根治的前立腺切除術を受けた前立腺癌患者からのものでした。書面によるインフォームドコンセントがすべての患者から得られたものであり、研究はヒト研究に関するUCSF委員会により承認されました。代替的に、前立腺癌組織マイクロアレイは、商業的供給源から入手し、miRNAはISHによって分析のために使用しました。分析前立腺癌患者のための臨床病理学的およびフォローアップ情報を収集しました。 1.組織サンプル<ol><li>製造業者のプロトコルに従ってH＆Eとのミクロトームや染色を用いて10μmの切片に前立腺癌組織サンプルをカットします。 </li><li>前立腺がん病巣の同定のための染色スライドだけでなく、隣接する正常な腺上皮を確認します。 注意：ボード認定病理医は、H＆E染色スライドとミリアンペアを確認する必要があります腫瘍および正常領域に対するRK。 miRNAのための後続のセクションのガイドが通常のエリア対腫瘍から分析するとマークされたスライドを使用してください。 </li></ol>定量的リアルタイムPCRによる2 miRNA発現解析注意：レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、（miRNAおよびmRNAを含む）全RNAを単離し、次のセクションで説明するようにTaqMan（登録商標）マイクロRNA発現アッセイを用いて、成熟miRNAのアッセイ：このワークフローは、以下の工程を含みます。 <ol><li> RNA抽出<ol><li>前立腺癌FFPE組織からのmiRNAの単離<ol><li>レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM） 注：化学ヒュームフードの手順2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4を実行します。 <ol><li> LCMのための組織スライド（10μmのセクション）を準備します。 10分ごとに、（2×）キシレンに浸してDeparrafinize組織切片を、蒸留に続く段階的エタノール（100％、95％、90％、80％、70％）で各5分間、スライドをインキュベートすることにより組織を再水和水（5分）。 </li><li>再水和後、30秒間ヘマトキシリン​​で染色のセクションでは、続いて水。 </li><li>段階的なエタノール（70％、95％、90％、80％、70％）（各5分）およびキシレン（5分）に入れ組織。 </li><li>その後、ドライヒュームフード内スライドとは、顕微解剖用のLCM器に置きます。 </li><li>製造元の指示24に従ってLCMシステムとmicrodissectionsを実行します。病理医が前立腺がん病巣だけでなく、隣接する正常組織の同定のためのガイドとしてスライドをマークアップされた使用します。 70〜90ミリワットの電力で10〜20ミクロンの直径のパルスのレーザービームを使用してください。 </li><li> LCMキャップ上に赤外線レーザーパルスで関心領域をキャプチャします。サンプルあたりのmiRNA抽出に2-5キャップから細胞を組み合わせます。抽出したRNAの完全性を確保するために、すぐにmiRNAの抽出のために捕獲された細胞を処理します。 </li><li>代替的に、miRNAの抽出緩衝液中の溶解細胞（メーカーのプロトコールに従って）およびSTO-80ºCで溶解物の再。 </li></ol></li><li> LCMマイクロダイセクション組織からのmiRNA抽出と分析<ol><li>製造者の指示に従って市販のキットを使用して、顕微解剖FFPE組織から全RNAを抽出します。 注：レーザーキャプチャーmiscrodissectionからのRNAの収量は、典型的には低いです。したがって、RNAは、少量（20〜30μL）中に溶出し、製造業者の指示に従ってタックマンマイクロRNA発現アッセイを用いた発現プロファイリング（また、セクション2.2に記載されている）のために使用されます。成熟miRNAのリアルタイムPCR検出のための入力RNAの最適化は、溶出されたRNAの5マイクロリットルを各miRNA特異的逆転写反応のために最適であることを示唆しています。内因性の対照として、RNU48 / RNU24が使用されます。コントロール反応のために、溶出されたRNAの2μlの逆転写反応に使用されます。 </li></ol></li></ol></li><li>前立腺癌凍結組織からのmiRNAの単離<ol><li> Homoge乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で組織を粉砕することにより凍結切除した前立腺組織をnize。冷却されたスパチュラを用いてマイクロチューブにホモジナイズした組織を転送します。組織は簡単に転送することができるように均質化し、液体窒素中に浸漬することにより、同じ温度で、乳鉢/乳棒とへらを維持します。 </li><li>ホモジナイズした組織に商業グアニジンイソチオシアネート - フェノール試薬（組織を1ml / 0.1 g）を加え、室温で5分間インキュベートします。 注：商業グアニジンイソチオシアネート - フェノール試薬中でホモジナイズした組織は、数ヶ月間-80ºCで保存することができます。 </li><li>ホモジネート（0.2ミリリットルのクロロホルム/ mlの）にクロロホルムを加え、30秒間激しく振ります。 4ºCで20分間10,000×gで遠心分離し、3〜5分間、室温でサンプルをインキュベートします。 </li><li>新しい滅菌RNaseフリー1.5mlチューブに上部の水相を転送します。 </li><li>イソプロピルアルコールを等量加えます。 10マイルのために混合し、インキュベートnはRTでRNAをペレットに4ºCで20分間12,000×gで遠心分離しました。 </li><li>上清を吸引し、70％エタノール1mLでRNAペレットを洗浄します。 4ºCで10分間12,000×gで遠心分離します。 </li><li>慎重に上清を吸引。 5〜10分間室温で乾燥RNAペレット。 50〜100μlのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶解します。 </li><li>ナノドロップ分光光度計を用いてRNAの定量化を行い、バイオアナライザーとRNAの完全性を決定します。 10 NG /μlにRNA濃度を調整します。 PCR分析リアルタイム（2.2節）に続いてmiRNA-特異的cDNA反応のために10〜50 ngのRNAを使用してください。 </li></ol></li></ol></li><li> miRNA発現解析のための定量的リアルタイムPCR 注：以下に記載されるように、二段階RT-PCRプロトコルを用いて成熟miRNAをアッセイ。 <ol><li>逆転写（RT） <ol><li>製造者の指示に従い、miRNAの逆転写キットを用いてRNAからcDNAを逆転写。マイクロRNAアッセイおよびRTキットからのmiRNA特異的プライマーを用いて全RNAの10〜50 ngのを使用してください。コントロールとしてRNU48 / RNU24 / RNU6Bを使用してください。 （分析miRNAの豊富さに応じて）1:10 5次のステップで説明するように、リアルタイムPCR検出に使用します。cDNAの1を希釈します。 </li></ol></li><li>成熟miRNAの検出のためのリアルタイムPCR <ol><li>製造者の指示に従い、高速ユニバーサルマスターミックスを用いてマイクロRNAアッセイを用いてcDNA試料からPCR産物を増幅します。 RNU48 / RNU24 / RNU6Bコントロールにサンプルを正規化します。高速リアルタイムPCRシステム上の遺伝子発現の相対的変化を計算するために、比較Ct（閾値サイクル）メソッドを使用します。三連で各サンプルを分析します。 </li></ol></li></ol></li></ol> in situハイブリダイゼーション （ISH） では 3. miRNA発現解析<ol><li>組織の前処理<ol><li>ミクロトームを用いてFFPE前立腺癌組織ブロックから5μmの切片をカットします。 </li><li&gt;は1時間56℃でスライドをインキュベートすることにより、組織切片を固定してください。 注：スライドは、miRNA分析のために数週間室温で保存することができます。 </li><li> 15分ごとに、キシレン（2×）でスライドを浸すことによって、組織をDeparrafinize。 </li><li>蒸留水（5分間）、続いて段階的なエタノール（100％（2倍）、95％、90％、80％、70％）中で5分間ずつスライドをインキュベートすることにより組織を再水和します。 </li><li>室温で20分間PBS中の4％パラホルムアルデヒドでスライドを修正しました。 </li><li>それぞれ5分間、室温でPBS（2×）でスライドを洗浄します。 </li><li>予熱したプロテイナーゼKバッファー中で10分間（5 mMのトリス塩酸pH7.4の、1mMのEDTA、1 mMのNaCl）で、37ºCで10 / mlのプロテ​​イナーゼKでスライドを扱います。 </li><li>プロテイナーゼK処理後、30秒間、PBS中0.2％グリシンを有するスライドをすすぎます。 </li><li> 5分間室温でPBS（1×）でスライドを洗浄します。 </li><li> 15分間PBS中の4％パラホルムアルデヒドでスライドを修正しました。 </li><li>スライドをすすぎで5分間、PBS。 </li></ol></li><li>ハイブリダイゼーション<ol><li>加湿チャンバー内55ºCで3〜4時間、プレハイブリダイゼーション溶液でスライドをプレハイブリダイズします。加湿チャンバーを維持するために、50％ホルムアミド/ 50％5×SSCに浸した組織ラボワイプを使用してください。 </li><li>ハイブリダイゼーション緩衝液中の20〜50 nMの濃度で5 &#39;ジゴキシゲニン標識プローブを使用してください。 、miRNA特異的プローブ（20〜50 nM）を、小さな核RNA U6コントロールプローブ（20 nM）を希釈して4分間90ºCでの熱、氷の上に置き、冷ハイブリダイゼーション緩衝液（2-4 NG /μLを氷に追加）。 </li><li>プローブ特異的ハイブリダイゼーション温度で12〜16時間インキュベート、ハイブリダイゼーション溶液（プローブ+ハイブリダイゼーション緩衝液、スライドあたり100μl）を追加し、プレハイブリダイゼーション溶液を除去（ハイブリダイゼーション温度= Tmのプローブ-21ºC）。加湿チャンバー（50％ホルムアミド/ 50％5×SSC）でハイブリダイゼーションを行います。 </li></ol></li><li>洗浄工程<ol><li> 45ºCで10分間の2×SSCでスライドを洗浄します。 </li><li>ウォッシュトン彼は45ºCで10分間1.5×SSCでスライドします。 </li><li> 20分ごとに37ºCで0.2×SSCの（2×）でスライドを洗浄します。 </li><li>室温で1〜2時間、1×ブロッキング溶液でスライドをインキュベート</li></ol></li><li>発見<ol><li> 1でスライドをインキュベート：100 PBSを1-4時間、または一晩、4ºCでAP結合抗ジゴキシゲニン抗体を希釈しました。 </li><li> 10分ごとに、室温でPBS（3×）でスライドを洗浄します。 </li><li> 5分ごとに室温でアルカリホスファターゼバッファー（100 mMトリスpHは9.5、50のMgCl 2、100mMのNaCl、0.1％のTween-20）とスライド（2×）で洗浄します。 </li><li> 1-20時間室温で暗所でのBMパープルAP基質でスライドをインキュベートします。 </li><li> PBSは、水中0.1％のTween-20および洗浄（2回）を含むでスライドを洗浄します。 </li><li>メディアのマウント水溶液を使用してスライドをマウントし、顕微鏡で調べます。 </li></ol></li></ol>

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The authors have no financial disclosures.

本稿では、アーカイブされたFFPEまたは新鮮凍結前立腺癌臨床組織中のmiRNA発現プロファイリングのための単純化されたワークフローについて説明します。前立腺癌では、いくつかの研究は、前立腺癌の開始、進行および転移におけるマイクロRNAの重要な役割を示唆しています。しかし、矛盾する結果は、多くの場合、miRNAを抽出するので、特定のmiRNA 22で得られると方法は広く異なっ?...

前立腺がんは男性の癌関連死亡率の主要な原因の一つである一般的に診断男性悪性腫瘍です。米国では、推定220800新たな症例と27540人の死亡は2015年1に報告されます。 前立腺癌は、腫瘍が無痛または非常に積極的であることができcourse-非常に可変性疾患を有する不均質な疾患です。前立腺癌の臨床管理における重要な課題は、疾患のスクリーニング、診断、予後および治療​​2のために現在使用されている方法/バイオマーカーの不足によってもたらされています。現在のスクリーニング方法は、前立腺生検3に続く前立腺特異抗原（PSA）試験及び直腸指診（DRE）が挙げられます。前立腺特異抗原（PSA）は、有意に臨床管理及び改善された生存率4に革命をもたらした最も広く使用されている前立腺癌のバイオマーカーです。しかし、LACを含むPSAの固有の制限のために特異性、PSAに基づくスクリーニングのkは診断の上、および疾患の治療の上につながっています。このビューでは、集中的な取り組みは、特に疾患の攻撃を予測し、より良い治療法の決定に4,5を駆動することができる、別の前立腺癌バイオマーカーの探索に向けられています。過去数年にわたり、マイクロRNA（miRNA）は、有望な代替前立腺癌バイオマーカーとして浮上しています。 マイクロRNA（miRNA）は、同族のmRNA標的の3 &#39;非翻訳領域（UTR）との配列特異的相互作用を介して転写後の遺伝子発現を抑制する小さな非コードRNAの進化的に保存されたクラスを構成します。これは、mRNAの&gt; 60％が6のmiRNAの標的を保存していると推定されます。 miRNA遺伝子は、遺伝子間領域内またはタンパク質/非タンパク質コード遺伝子のイントロン7またはエクソン内に位置しています。これらの遺伝子は優先的プリマに、RNAポリメラーゼIIによって転写されますヘアピン状のステムループ二次構造を形成RYのmiRNA（数キロベースの長いPRI-miRNAは、）。これらのpri-miRNAは、細胞質に輸送し、さらに成熟miRNA（18〜25ヌクレオチド長）8-10に加工された前駆体のmiRNA（プレmiRNAは、60〜75ヌクレオチド長）に加工されています。 miRNAは、増殖、発生、分化およびアポトーシスを11などの主要な細胞プロセスを調節します。研究では、前立腺癌12-15を含む種々のヒト悪性腫瘍におけるmiRNA発現プロファイルの広範な調節不全を示唆しています。 miRNA発現プロファイルは、広く原発性および転移性前立腺癌において異常調節されることが報告されています。改変されたmiRNAの発現は、前立腺癌の進行、攻撃性とのmiRNA 12,14,16-19の予後の可能性を強調再発とリンクされています。証拠の成長体は、miRNAが、前立腺癌の発生、発達、進行中の重要な機構的な役割を果たしていることを示していますイオンおよび転移。全体的に、miRNAは、前立腺腫瘍12の層別化に正常組織および癌組織と援助とを区別することができる前立腺癌の診断および予後のための有望な代替のバイオマーカーを浮上しています。また、miRNAは、前立腺癌20に対する有効な治療薬の開発のための重要な標的です。 その小さなサイズと、内因性RNase活性に対する抵抗性のために、miRNAは、容易に、ホルマリン固定組織21及び22の前立腺生検で検出することができる安定したバイオマーカーです。さらに、miRNAの発現プロファイルは、凍結およびホルマリン固定組織で比較されており、21強く相関することが見出されています。しかし、前立腺癌臨床組織においてmiRNA発現プロファイリングはしばしば重くRELI前立腺癌のための有効なバイオマーカーとしてなど、エラーをサンプリングする、腫瘍の不均一性に起因するmiRNAの開発を間質汚染を挑戦され臨床組織における自分の正確な検出にES。ここでは、アーカイブFFPEまたは新鮮凍結前立腺癌臨床検体でmiRNA発現プロファイリングのための私たちの研究室で使用される単純化されたワークフローについて説明します。我々は、定量的リアルタイムPCRの組み合わせを採用したmiRNAのためのin situハイブリダイゼーション旧得、より定量的な情報および組織の配列に潜在的なmiRNAバイオマーカーの発現差異を可視化するため、後者で、臨床検体の分析。このワークフローの中で、私たちはFFPE、凍結前立腺組織からのmiRNA抽出のための既存の方法論を最適化し、式はロックされた核酸（LNA）を用いたin situ ハイブリダイゼーション技術でのTaqmanプローブベースのmiRNA RT-PCRおよびmiRNAの分析により、プローブ23をベース。 LNAベースのプローブは、DNAまたはRNA-ベースのプローブと比較して増加した感度と特異性を提供し、すべてのmiRNA配列のロバストな検出を可能に関係なく、GC含量のもdiscriminaを許可miRNAファミリーのる。我々の最適化されたmiRNAのISHプロトコールは、miRNAバイオマーカーの発見を加速する可能性を提供し、後者で、前立腺癌組織スライドまたは前立腺癌組織マイクロアレイ（TMA）に適用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus Autopix for LCM</td>
			<td>Arcturus/ Life Technologies</td>
			<td>LCM1621/LCM1110</td>
			<td>Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real Time PCR System&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Universal PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG labeled LNA probe for U6</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>99002-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM Purple AP substrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-hybridization solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-conjugated anti-digoxigenin antibody</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>H-5501&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>SL200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>SL201&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues

前立腺癌（PCA）臨床管理における重要な課題は、疾患のスクリーニング、診断、予後および治療のために現在使用されているバイオマーカーの不足によってもたらされています。近年では、マイクロRNA（miRNA）は、前立腺癌の診断および予後のための有望な代替バイオマーカーを浮上しています。しかし、前立腺癌のための有効なバイオマーカーとしてのmiRNAの開発が重く、臨床組織におけるそれらの正確な検出に依存しています。 miRNAは、多くの場合、腫瘍の不均一性、サンプリングエラー、間質汚染などのmiRNAは、組み合わせのを使用して、アーカイブFFPEや新鮮凍結前立腺癌臨床検体で分析するために、この記事の目的は、単純化されたワークフローを記述することであるために挑戦された前立腺癌臨床検体で分析します定量的リアルタイムPCR（RT-PCR）、およびインサイチュハイブリダイゼーション （ISH）。このワークフローの中で、私たちは、FFPEからのmiRNA抽出のための既存の方法論や凍結前立腺TISSUを最適化ESおよび発現は、タックマン・プローブベースのmiRNA RT-PCRにより分析します。ベースのプローブ - 加えて、我々は、ISHのための最適化された方法は、ロックされた核酸（LNA）を使用して、前立腺組織においてformiRNA検出を分析記述する。我々の最適化されたmiRNAのISHプロトコールは、前立腺癌組織スライドまたは前立腺癌組織マイクロアレイ（TMA）に適用することができます。

RT-PCRによってLCM原発性前立腺癌臨床検体におけるmiR-203の発現プロファイリング分析（図1） RT-PCRは、LCM原発性前立腺癌組織中のmiR-203の相対的発現の分析及びコントロールとして使用したSAINI ら RNU48 15で説明したようにマッチした隣接する正常領域を行いました。以下の表は、隣接する正常組織に比べて前立腺癌腫瘍組織における相対的なのmi...

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miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K ビュー.  University of California San Francisco. Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

ビデオ: miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

医学

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Cancer development is a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor cells, immune cells, fibroblasts and endothelial cells. Each type of cells undergoes signaling and functional changes during carcinogenesis. The current challenge for many cancer researchers is to dissect these changes in each cell type during the multiple-step process in vivo. In the last few years, the authors have developed a set of procedures to isolate different cell populations during skin cancer development using K14creER/R26-SmoM2YFP mice. The procedure is divided into 6 parts: 1) generating appropriate mice for the study (K14creER+ and R26-SmoM2YFP+ mice in this protocol); 2) inducing SmoM2YFP expression in mouse skin; 3) preparing mouse skin biopsies; 4) isolating epidermis from skin; 5) preparing single cells from epidermis; 6) labeling single cell populations for flow cytometry analysis. Generation of sufficient number of mice with the right genotype is the limiting step in this protocol, which may take up to two months. The rest of steps take a few hours to a few days. Within this protocol, we also include a section for troubleshooting. Although we focus on skin cancer, this protocol may be modified to apply for other animal models of human diseases.

Carcinogenesis is a process involving interactions between cancer cells and the cancer microenvironment. To dissect the molecular events, one needs to isolate different cell populations at different stages during cancer development. Using a mouse model for basal cell carcinoma, we describe a protocol for cell analyses during carcinogenesis.

細胞集団分析スキン発がん中

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

低分子CLT1ペプチド標的造影剤を用いて前立腺がんの分子イメージングのMR

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

トランスレーショナルがん研究のためのヒト組織での作業

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2-&#916;&#916;ct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients&#039; Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.

定量PCRを通じて非小細胞肺癌（NSCLC）患者の血漿中のエキソソームのmiRNA解析：実行可能な液体生検ツール

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Methods Article

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析