この体積電子顕微鏡法は、3次元構造の観察を必要とする生物学的研究を行うために使用される。イメージを取り返す前にロッド、野手ビュー、サンプルストレージを提供します。Fx2 Asanは、脱衰弱を触媒してターゲット構造の電子試験を増加させ、特定の対象を特定するために使用できるパスステージを設計しました。
これらの粒子は、相関光と3次元電子顕微鏡技術を組み合わせて、膜状の小器官と宿主細胞の相互作用を調べる。トランスフェクション後16~24時間、250マイクロリットルの30~37度の固定液で培養液を静かに洗浄します。洗浄液を1.5ミリリットルの新鮮な固定溶液に素早く交換し、培養液を氷の上に30分間置く。
インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき氷冷0.1モルカコチル酸緩衝液の1ミリリットルで30分間の洗浄で細胞をすすぐ。最後の洗浄の後、氷冷0〜4度20ミリモルグリシン溶液を1ミリリットル加え、氷の上に10分間のインキュベーションを行い、その後、洗浄ごとに新鮮で冷たい0.1モルナトリウムカコチル酸緩衝液を1ミリリットルで3回5分間洗浄します。次に、500マイクロリットルの新しく調製されたDAB溶液で細胞にラベルを付けます。
そして、約5〜45分間氷上の細胞をインキュベートします。逆光顕微鏡下で薄茶色の汚れが見える場合は、1回の洗浄で1ミリリットルの新鮮な冷たい0.1モルナトリウムカコチル酸緩衝液で細胞を3回洗い流します。次に、位相差反転顕微鏡を使用して、DAB染色を100倍以上の倍率で可視化し、対象領域が配置されているガラスの底部に印を付けます。
電子顕微鏡用ブロック試料調製物については、まず、4度で1時間四酸化オスミウムを2%減少させた1ミリリットルで細胞を後固定する。固定の終わりに、3回の5分間の洗浄と1回の新鮮な蒸留水で細胞を洗い流します。20分間濾過TCH溶液の1ミリリットルで細胞を処理する前に.
インキュベーションの終わりに、ちょうど実証したように蒸留水で細胞を3回洗浄し、2%減少した四酸化オスミウムで30分のインキュベーションで細胞を固定します。2回目の固定の終わりに、蒸留水で細胞を3回洗浄し、1ミリリットルの酢酸水溶液を光から保護した摂氏4度で一晩で覆います。翌朝、60度の1ミリリットルの摂氏1ミリリットルで染色する前に、蒸留水で細胞を3回洗い、ウォルトンの鉛アスパラギンス溶液を60°Cのオーブンで30分間温めた。
インキュベーションの終わりに、蒸留水で細胞を3回洗浄します。20分2ミリリットルエタノールアリコートのグレードシリーズで培養を行います。最後の100%エタノール暴露後、3~1エタノールの1ミリリットルで30分間、室温で低粘度埋め込み混合物培地にインキュベートする。
インキュベーションの終了時に、培地を1対1のエタノールの1ミリリットルに置き換え、室温でさらに30分間インキュベーションするために低粘度埋め込み混合物培地にします。次に、培地を1~3個のエタノールの1ミリルターで、低粘度埋め込み混合物培地に対して、室温でさらに30分間交換する。次いで、培地を1ミリリットルの100%低粘度埋め込み培地で一晩交換し、続いて、60°Cで24時間混合した低粘度でサンプルを埋め込む。
透過型電子顕微鏡分析では、翌日、超ミクロトームを使用して90ナノメートルの厚い切片を得て、200キロボルトの透過電子顕微鏡下でグリッドを観察します。サンプル調製を開始する前に、きれいなインジウムスズオキシドは30〜60秒間イソプロパノールで穏やかな攪拌でガラスカバーリップをコーティングしました。攪拌の終わりに、余分なアルコールを排出し、ほこりのない環境にカバーリップを置きます。
カバーリップが乾燥しているときは、プラズマコーターを使用してカバーリップを1分間放電します。次にカバーリップを基板ホルダーに挿入し、基板ホルダーをナイフボートに入れます。走査型電子顕微鏡のサンプルを得るために、埋め込まれたサンプルブロックをウルトラミクロトームのサンプルホルダーに挿入します。
そして、ホルダーをトリミングブロックにセットします。カミソリの刃を使用して、ブロックの面が台形または長方形になるように、ターゲット位置の周りに余分な樹脂をトリミングします。先頭と末尾のエッジは、互いに厳密に平行にする必要があります。
多数のシリアルセクションを取得するのは容易ではありません。ただし、リーディング エッジと後続エッジは完全に平行である必要があります。次に、サンプルホルダーをウルトラミクロトームのアームに挿入します。
ナイフホルダーにダイヤモンドナイフを入れ、ナイフボートにろ過蒸留水を入れます。次に、ホルダーのハンドルを慎重に押して、カバーリップの端がナイフに近づくようにキャリアの位置を調整します。サンプルを入手した後、切り抜きプロセスを停止し、チューブのクランプスクリューをゆっくりと開け、水上ボートを排出します。
リボンの収集プロセスが完了したら、クランプ装置のハンドルで基板を取り外し、リボンを乾かします。目的のタンパク質を発現する遺伝的にタグ付きプラスミドを用い、タグ付きタンパク質の染色後にトランスフェクトされた標的細胞の同定を可能にする。その後、コ相対光電子顕微鏡法を用いて、標識された細胞培養をさらに可視化することができる。
例えば、SCO1-APEX2によって生成された暗い汚れは、ミトコンドリアのマトリックス空間ではなくミトコンドリア膜間空間においてのみ観察される。コードトランスフェクト細胞は、SCO1-APEX2およびHRP-KDELプラスミドの両方を用いて、ミトコンドリア膜間空間および小胞体において高密度の電子信号を発現する。しかし、SCO1-APEX2にトランスフェクトされた細胞では小胞体染色は認められていない。
走査型電子顕微鏡による逐次イメージングでは、大面積の後方散乱電子検出器を用いてアレイ全体の画像全体の概要を作成します。次に、対象となる領域が最初のセクションに配置され、他のすべてのセクションに反映されます。最後に、5つの標的細胞を含む対象領域を5ナノメートルの画像化されたピクセルで画像化する。
拡大は、ゴルジ装置、ミトコンドリア、およびエンドポラス系レチクルムなどの詳細な細胞下構造を明らかにする。シリアルイメージングは、異なるZプレーンで小胞子ミトコンドリア接点が起こることを明確に明らかにします。相関光と電子顕微鏡を使用して特定のターゲット構造を特定の識別法の影響を調べる方法を理解しておく必要があります。
これらの染色技術と体積電子顕微鏡を組み合わせることで、特にユーロウイルスにおける細胞相互作用を調査するために、より大きなスケールのEMに使用できる。グルタルアルデヒド、またエンテロサイドおよびTCHは非常に有毒ですので、防護服を着用し、これらの材料を使用する際にヒュームフードで動作するようにしてください覚えておいてください。
