この作品は、KTに国立衛生研究所（NCI R00 CA132784）によってサポートされていました

1。臍帯血から単核細胞の単離<ol><li> 95ミリリットルすすぎバッファ（1:20希釈）にEDTA-PBS緩衝-addを5ミリリットルウシ血清アルブミン（BSA）のストック溶液を調製します。ドガバッファと氷の上でバッファを保つ重要：気泡が分離カラムをブロックする可能性があるため、CD19 + B細胞を単離する際に脱気に失敗すると、バッファが最適な結果未満になることがあります。 </li><li>密度勾配遠心法を50mlコニカルチューブを準備します。臍帯血を処理するために必要な管の数（1管は8ミリリットルの血液を処理することができます）を決定し、各チューブへのFicoll-Paque PLUSの15ミリリットルを追加します。 </li><li> 24ミリリットルのDPBS（1X）と​​臍帯血の8ミリリットルを希釈し、慎重に50 mlコニカルチューブの各々でのFicoll-Paque PLUSの上の層薄めた臍帯血の混合物を。血液とのFicoll-Paque PLUSを混ぜて使用しないでください重要：臍帯血とのFicoll-Paque PLUSの混合を避けるために、45度の角度でチューブを保持し、層血液混合物にゆっくりと。 </li><li> 20℃で40分間、400×gで遠心分離し、単核細胞（MNC）はプラズマのFicoll-Paque PLUSのFicoll-Paque PLUSの浸透圧で高密度に堆積物による顆粒球や赤血球に対しインターフェースのままになります。サンプルID、日付、次のとパート3で使用されるラベル7 5ミリリットル丸底チューブ： </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> チューブ </td><td> ラベル </td><td> 目的 </td></tr><tr><td> 1 </td><td>染色されていない</td><td>フローサイトメトリーの間に正規化のための非染色細胞</td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td>フローサイトメトリーの間に生存率を決定するために、 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + + </td><td>ソートされた細胞が含まれています</td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> CD34 + / CD19を収集するには+（後期プロB - 早期プレBI）の細胞</td></tr><tr><td> 5 </td><td> 低い 45 </td><td> 低 / CD19 + / CD45（プレBI）の細胞- CD34を収集するには</td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 MED </td><td> / CD19 + / CD45 MED（プレBⅡ） -細胞CD34を収集するには</td></tr><tr><td> 7 </td><td> 高さ 45 </td><td> / CD19 + / CD45 高 （未熟B）細胞- CD34を収集するには</td></tr></tbody></table>コー​​トチューブ4、5、6、2％FBSを含む7と氷の上で全てのチューブを配置します。 <ol start="5"><li>慎重に上部の血漿層を吸引除去し、単核細胞層との接触を避ける。 10ミリリットルガラスピペットを用いて、慎重に新しい50 mlコニカルチューブに単核細胞層を転送します。シングル50 mlチューブに一緒に3つの管から単核細胞を兼ね備えています。 </li><li>穏やかに混合し、10分間、300×gで遠心分離し、PBSでチューブを埋める20℃慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去する。 1xを繰り返します。最初の洗浄後、ペレットを再懸濁し、単一の50 mlコニカルチューブに移す。 </li><li>穏やかに200μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁します。 、細胞懸濁液の1μlを取り外し1.5 mlマイクロチューブに1mlのPBSに追加して（遠心機で50mlの細胞懸濁液を配置した後にセルをカウント）カウントするために脇に置きます。 PBSでチューブを記入し、血小板を除去するために15分間、200×gで遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく、完全に上清を取り除きます。 </li></ol> 2。 MACS分離を用いて単核細胞から修正されたB細胞の単離<ol><li> 160μlの冷（4℃）、EDTA-PBS緩衝液でステップ1.7からペレットを再懸濁します。 </li><li> 40μlのB-CLLビオチン抗体カクテルを追加します。 4℃でよく混ぜ、10分間インキュベートしたピペット</li><li>細胞を洗浄 - 10万セル（セルNU当たり1ミリリットル冷（4℃）、EDTA-PBSバッファー追加mberは、ステップ1.7）で決定し、10分間300×gで遠心分離します。完全に上清を吸引除去し、その後、320μlの冷（4℃）、EDTA-PBS緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 80μlの抗ビオチンマイクロビーズを追加し、4℃でよく混ぜ、15分間インキュベート</li><li>細胞を洗浄 - 10分間、300×gで1 mlの冷（4℃）で10万個の細胞と遠心当たりEDTA-PBSバッファーに追加します。冷（4℃）、EDTA-PBSバッファー500μlに億セルまで再懸濁する。細胞数に応じてスケールバッファ量。 </li><li>遠心分離（ステップ2.5）中にMACSカラムとMACSセパレータを準備します。 、MACSセパレータの磁場中でのLSカラムを配置するカラムに冷（4℃）、EDTA-PBS緩衝液3mlを加えるとバッファがカラムを垂れることができます。を通る流れをキャッチするためにレセプタクルを使用します。フロースルーを捨てる。 </li><li>列の下に50 mlコニカルチューブを配置し、カラムに細胞懸濁液をピペット。非標識細胞はthrougドリップすることができますH列及び50 mlコニカルチューブに。重要：これらの抗体標識と細胞選別のために使用される細胞である。フロースルーは捨てないでください。ステップ2.5からの細胞のすべてを回復するには、コニカルチューブの壁に冷（4℃）、EDTA-PBSバッファーの追加の1 mlを加える。静かに混和し、カラムに残っている細胞懸濁液をピペット。 1xを繰り返します。カラムを通過した後、コニカルチューブに収集する非標識細胞を用いて2.8に進みます。 </li><li> 10分間300 xgでPBSおよび遠心分離機で標識されていない細胞を含む円錐管を埋める。慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去する。 EDTA-PBSバッファー200μlを加え、穏やかに細胞を再懸濁します。 </li></ol> 3。細胞選別のための抗体標識と準備<ol><li> （ステップ1.4）、 &quot;染色&quot;というラベルの付いたチューブに細胞懸濁液と場所の1μlを吸引します。 500μlのEDTA-PBSバッファーを加え、チューブを氷上に保存してください。 </li><li> 20を追加残りの細胞懸濁液中に万個の細胞あたりの各抗体液（CD19、CD34およびCD45）。よく混和し、室温で30分間、暗闇の中でチューブを配置します。ライトがオフになっているCD抗体は2-4光感受性、完全な手順は次のとおりです。 </li><li>抗体とのインキュベーションの30分後、細胞懸濁液40μlを吸引し、 &quot;7AAD&quot;というラベルの付いたチューブに入れます。 2分間、500×gでチューブと遠心分離機に1mlのPBSを追加します。上清を除去し、結合用緩衝液100μlの中に細胞を再懸濁します。 7AADの7μlの（7-Aminoactinomycin D）を追加し、室温で10分間、暗所でインキュベートする。 10分間のインキュベーションの完全なステップ3.4の間。 </li><li> CDの抗体で標識され、残りの細胞を含むチューブの上部にPBSを追加します。 3分間、500×gでチューブを遠心分離します。上清を除去し、500μlのEDTA-PBSバッファーを添加し、細胞ペレットを再懸濁します。 &quot;+ + +&quot;というラベルの付いたチューブに細胞懸濁液の全量を移す。細胞懸濁液の全てを回復するには&quot;+ + +&quot;というラベルの付いたチューブに50 mlコニカルチューブおよび転送するためには、ddには、追加の1ミリリットルEDTA-PBSバッファー。 </li><li>インキュベーション後（ステップ3.3）、7AADチューブに300μlの結合バッファーを加える。 &quot;染色&quot;、 &quot;7AAD&quot;や&quot;+ + +&quot;サンプルと&quot;34 +&quot;、 &quot; 低 45&quot;、 &quot;45 MED&quot;と&quot;45 高い &quot;チューブは、フローサイトメトリーのための準備が整いました。 </li></ol> 4。 MoFloのXDPフローサイトメーターを用いて細胞ソーティング<ol><li>ソート用MoFloアップセット：レーザーの位置を合わせ、液滴の流れを安定させる、廃棄遅延を決定する。 </li><li>製造元の指示に従って、インビトロジェンABCマウスビーズキット（あるいは同様のもの）を使用して、単一の色補正コントロールを準備します。正と負の集団の最適な分離のための蛍光チャンネルの電圧を調整して、単一のカラーコントロールを実行します。補正係数を設定し、収集プロトコルに補正パラメータを適用します。再確立補償係数抗体の新しいロットが得られるたびに。 </li><li> 図2に示すように、プロットなどのプロトコルを作成します。 </li><li>前方および側方散乱のために染色されていないサンプル、セット電圧とゲインを実行して、負の蛍光集団を同定する。 DNAの回収は、ソートの目標であるため、しきい値が低く設定されるべきです（≤1％）ので、DNA含有破片は回収試料を汚染しない。 *エアゾール避難システムは、人間の細胞がMoFlo上で実行されている生きているすべての回で実行されていることを確認します。 </li><li>ゲーティング戦略（ 図2）を設定するには、+ + +のサンプル（〜50,000イベント）の小アリコートを実行します。 B細胞の前駆細胞が成熟B細胞と同様に散布しないため、リンパ球ゲートは、潜在的なプロB細胞を含むことを確認するために、+ / CD34 +集団SSC対FSCのプロット上にゲートなしCD19をバックゲート。このサンプルからも7AADで負の蛍光人口を設定します。 </li><li>サンプルの実行可能性を判断するために7AADサンプルを実行します。で高生存率を有する試料からの種の細胞のみ死んだ細胞のように冒頭（≥95％）が無差別に染色するとソート集団を汚染する可能性がある。 </li><li> 4つの集団を収集するためにソートの決定を設定します。CD19 + / CD34 +、CD19 + / CD34 - / CD45 低い ; CD19 + / CD34 - / CD45 MED、およびCD19 + / CD34 -ハイ / CD45。すべての集団の一種の意思決定におけるリンパ球とダブレット判別ゲートを含む。 </li><li>ソーティングチップに目詰まりを防止するために、フィルタ+ +任意の集約は、ソート中に試料中に発生した場合に、ソートや再フィルタ直前40μmのセルストレーナーを通して+サンプル。 </li><li>冷却または氷パックチューブホルダーにPBS中2％FBSで被覆された採血管（ステップ1.4）に細胞をソートします。 </li><li>ソートが完了した直後には、DNAを抽出する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+(TDMs)+with+differential+gene+expression.">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li><li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells.">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis.">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li><li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow.">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li><li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow.+II.+Normal+B+lymphocyte+development.">Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development.</a> Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).</li><li>Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursors+in+normal+pediatric+bone+marrow.">B-cell precursors in normal pediatric bone marrow.</a> American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).</li><li>Tucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+cord+blood+B+cells+functionally+mature?.">Are cord blood B cells functionally mature?.</a> Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li><li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci.">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li><li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children.">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li><li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression.">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li><li>Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis.">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li><li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , 7.1.1-7.1.7 (1996).</li><li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+human+B-cell+precursors.">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li><li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells.">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li><li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+immature/transitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease:+correlation+with+increased+IL-7.">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

プロトコルの成功に最も大きな影響を与える要因は、破片を汚染の存在である。臍帯血バンクから血液を要求するなら、それは可能な限り採取後できるだけ早く出荷血を持つことが重要です。また、リンパ球に分類されているサンプルでは、​​リンパ球の高い数字が含まれていますが、これらのサンプルは、前駆体B細胞の十分な数を持っていないので、使用しないでください。前駆体のサブセットごとに細胞の十分な数を得る確率を高めるために私たちは、臍帯血の少なくとも85ミリリットルで始まるをお勧めします。 それは成人末梢血の分離とは異なり、臍帯血単核球を分画したときに層がしばしば赤血球12で汚染されていることに注意することが重要です。このプロトコルは、汚染血小板を除去するために余分な洗浄工程が含まれています。臍帯血から単核球分離を記述するプロトコルは溶解ステップt含めて示唆している不要な赤血球を除去O。それは汚染瓦礫を生成し、細胞種の成功に悪影響を及ぼしますので、我々は、この手順をお勧めしません。 フローサイトメトリーによって区別されなければならないセルの数を削減するためには、事前の細胞選別へのB細胞の濃縮を行う必要がある。 B-Cellアイソレーションキット（B-CLL）に付属Miltenyi Biotec社、によって提供されるプロトコルは、末梢血のために最適化し、10万個の細胞あたり10μlのB-CLLビオチン抗体カクテルを使用することをお勧めされています。 、CD4（T細胞）は、CD11b（顆粒球、単球、マクロファージ）、CD16（NK細胞、マクロファージ、マスト細胞）、CD36（血小板）、CD235a（赤血球）、このステップは、CD2（NK細胞、T細胞）に対する抗体を使用しています臍帯血から非B細胞を枯渇させる。旧キットはプロB細胞上に存在するCD43に対する抗体が含まれているため、B細胞分離キットIIに記載していないキットを使用することが重要です。私たちの中にOPこのプロトコルのtimization、我々は、B-CLLビオチン抗体カクテルを40μlの合計が陽性細胞のソート結果を生成するのに十分であることがわかった。加えて、我々は、B-CLLビオチン抗体カクテルのわずか5μlの詳細を使用してセルのソートに悪影響を持っていたことが分かった。したがって、我々は非常に175から250000000の間の全単核細胞数のため、B-CLLビオチン抗体カクテル40μlの使用をお勧めします。細胞の低い、または高い数字で始まる場合、それはそれに応じて試薬をスケーリングする必要があるかもしれません。 B細胞の亜集団を区別するために使用することができるマーカーを記述する多数​​の競合の出版物があります。食い違いのほとんどは分化が進行中のプロセスであり、細胞表面マーカーの有無が緩やかな方法で代わりにオール·オア·ナッシングの方法で発生したという事実によって説明することができます。 / CD19 +およびCD45 +（の強さのレベル-このプロトコルは、CD34で）、低、中、高発現は、分化6の進行に対応した、CD45発現レベルの増加に伴って、事前のBI、プリBIIと未熟なB細胞を区別するために使用されていました。プロB細胞は、他の人がプロB細胞はCD19であることが示されている一方、CD19 + / CD34 + 13であることがいくつかによって記載されている+と-のプレBIの細胞/ CD34、CD19 + / CD34 + 9,10です。これらの相違に基づいて、我々は遅れてプロB細胞/早期プレBIの細胞としてCD19 + / CD34 +細胞を指定している。それは、この戦略は前駆疾患急性リンパ芽球性白血病の影響を受けた細胞に相当するB細胞のサブセットを分離するために開発されたことに注意することが重要です。しかし、目的の細胞サブタイプに応じて採用することができる複数の選別戦略があります。 抗体蛍光色素の組み合わせが利用できるセルソーターの能力に基づいて選択されるべきである。属としてリットルルール、パネルの中で最も明るい蛍光色素は、少なくとも人口の多い抗原およびその逆にラベルを付けるために使用されるべきである。特に二重染色集団、このような稀な事象を検出する際に、二重差別（ 図2B）は、ゲーティング戦略の極めて重要な部分です。これは、ダブルポジティブイベントは、抗体ではなく、単に互いに接着2単一染色した細胞の両方で染色真に単一細胞であることを保証。 高速、4ウェイ細胞選別は、必ずしも制御エアロゾル環境を作成します。従って、ヒト細胞選別を生きるには細心の注意を払って行う必要があります。公開された安全性と除染ガイドラインが利用可能であり、ソート前に14日、実施されるべきである。インスティテューショナル·バイオセーフティ委員会、あるいはそれと同等の承認は、ソートする前に必要になることがあります。ソート後の適切な除染については、漂白剤を10％の最終濃度に廃棄容器に入れておいてください。シmilarly、すべてのサンプルチューブと同様に即時のエリア内のすべての表面が十分にたて10％漂白剤溶液を用いて除染すべきである。 要約すると、このプロトコルは、前駆体B細胞の珍しい個体を得るための戦略を提供し、造血幹細胞とT細胞未熟含む臍帯血中に存在する任意の希少な個体群を単離するために変更される場合があります。最近では、未熟なB細胞が進行したHIV 15の個体の末梢血中に同定されている。したがって、この方法の有用性は、血液のがんの研究を越えて延びている。最後に、我々はまだ流れ選別された細胞にRNAの単離を行っていないが、この方法は、細胞を選別する時のセルがTRIZOLや、RNeasyキットからRLTとして同等のRNA互換性のあるソリューションに直接ソートされている必要があるという警告と適応する必要がありますキアゲンから入手。

病気に存在する収差を識別するためには、それは我々が病気に罹患した組織または細胞型に対応して、健康な組織や細胞を使用することは非常に重要です。この理由の1つは、組織の種類間のエピジェネティックな変化は、遺伝子発現を調節するための責任があり、正常な人間開発の1,2時の細胞分化のために重要です。 2番目の理由は、異常な組織特異的遺伝子発現制御は、通常の開発に悲惨な結果があるかもしれません、癌などの疾患状態の多数に寄与することが知られています。したがって、造血細胞を伴う疾患のより良い理解は、健康な造血細胞の知識が必要です。 細胞表面マーカー3の発現の変化によって特徴付けられる事象の体系的な順序を通じて骨髄進行中の造血細胞の開発。大人の参加者を対象とした研究があり小児科の参加者を対象とした研究では、前駆体B細胞の割合が5年未満6歳の個体では比較的高いことが示されているのに対し、骨髄は通常B細胞前駆体4,5の数が少ないが含まれていることを示す。臍帯血は、血液関連疾患や悪性腫瘍の治療に造血幹細胞の供給源として使用臍帯血バンクを介して容易に利用可能で、白血病を含む複数の疾患の標的細胞である未熟なB細胞およびT細胞7用に濃縮されており、リンパ腫。 骨髄中の前駆B細胞が広範囲に8,9表現型解析されており、異なるサブセットにこれらの細胞を選別するために使用することができ、特定の細胞表面マーカーの存在によって定義することができます。最古のプロB細胞と骨髄初めに一連のステージを介した通常のB細胞分化が進み、未熟またはナイーブB細胞で最高潮に達する。従ったCD19（プリBI）バンZELMら10に、プロB細胞は、CD34の存在によって特徴付けられるとステージ2への移行期に獲得されます。もはやステージ3（プリBII）細胞はCD34を発現し、細胞質IgMを発現し始める。最後に、ステージ4の決定的な特徴は、（B細胞未熟）表面IgMの発現である。このプロトコルで説明されたソーティング戦略は、まずコールドウェルら6で説明され、大幅に複雑と細胞選別実験を行った場合のコストを低減するだけで3つの細胞表面マーカーの使用が含まれていた。自分の仕事では、CD45およびB細胞分化の段階との関係が確立されました。彼らは、骨髄中のB細胞はCD45の発現の可変レベルを表示することを観察した。具体的には、CD45の高レベルで発現した細胞が表面IgMを発現した細胞（未熟なB細胞）に対応し、CD45の中間レベルを表明したものはcytoplを発現する細胞に相当するasmic IgM型（プレBII細胞）、およびCD45を低レベルで発現しているものは、（事前のBI細胞）細胞質IgMを発現していない細胞に相当した。このプロトコルは、B細胞などのメチル化CpGアイランドの回復アッセイ（MIRAのような高品質の核酸を必要と下流のアッセイに使用することができる臍帯血（ 図1）から前駆体のサブセットを分離するコールドウェルら6によって開発された戦略を使用しています）11および定量的リアルタイムPCRアッセイ。この方法は、臍帯血からのすべての非B細胞を枯渇させるために磁気ビーズを用いた初期分離を採用しており、わずか3抗体（CD34、CD19およびCD45）で染色する必要があります。回収された細胞は、B細胞分化の4段階を表す：1）CD34 +、CD19 +（後期プロBおよびpre-BI早い）、2）、CD34 - 、CD19 +、CD45低い （後期プレBI）; 3）CD34 - 、CD19 +、CD45 MED（プリBII）、4）、CD34 - 、CD19 +、CD45高 （未成熟B細胞）。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multi Stand</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-660</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATLANTA Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>SS1500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560941</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347463</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CY30230</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck Alignment beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Rainbow Alignment beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URFP-30-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViroSafe Aerosol Evacuation Filter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML01330</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Mouse bead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10344</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &mu;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Evacuation Unit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of precursor b-cell subsets from umbilical cord blood

臍帯血は、高度の異なる系統のコミットメントの段階で造血前駆細胞が濃縮されています。我々はB細胞分化の4つの異なる段階で前駆体を単離するためのプロトコルを開発してきました。遺伝子が発現し、エピジェネティックな修飾は、組織特異的な方法で行われているので、それはゲノムと疾患の発症につながる可能性エピゲノムの変化を識別できるようにするために、組織や細胞の種類を区別することが重要です。このメソッドは、分化のどの段階で臍帯血中に存在する細胞の任意の型に適合させることができます。 この方法は、4つの主要なステップを含む。まず、単核細胞密度遠心分離によって分離されている。第二に、B細胞は単核細胞から非B細胞を認識して削除するビオチン標識抗体を用いて濃縮されている。第三のB細胞は蛍光個々の段階に特異的な細胞表面タンパク質抗体で標識されているB細胞の開発。最後に、蛍光標識された細胞は、ソートされ、個々の集団が回収される。回収された細胞は、下流の核酸アッセイに利用するのに十分な量と質である。

サンプル間のばらつきは、セルのソート（ 表1）の成功に重要な役割を果たしている。良い成功率を持つサンプルが汚染瓦礫のレベルが低い（ 図3A）を持っていると貧しい成功率を持つサンプルが汚染瓦礫の高レベル（ 図3B）を持っています。臍帯血サンプルは出荷の24時間（O / N最優先）内で収集された場合は、サンプル間のばらつきが多少制御することができます。 各前駆B細胞サブセットからの流れ選別された細胞は、核酸アイソレーションを実行するのに十分な量と質である。単離されたDNAは、高品質のものであり、下流の分析に使用することができます。我々は日常的にメチル化DNA（ 図4）を濃縮するためにミラ11でこのDNAを利用しています。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 臍帯血ファシリティデータ </td><td> 悪い並び替え </td><td><stチョロン&gt;グッド替え</td></tr><tr><td>抗凝固剤とワーキング血液量（ml）を</td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td>白血球[10 3 /μlで] </td><td> 8.68 </td><td> 11.19 </td></tr><tr><td>リンパ球[10 3 /μlで] </td><td> 3.88 </td><td> 3.76 </td></tr><tr><td>リンパ球（％） </td><td> 44.70 </td><td> 33.6 </td></tr><tr><td>赤血球[10 6 /μL] </td><td> 3.65 </td><td> 3.05 </td></tr><tr><td colspan="3"> 社内データ </td></tr><tr><td>のFicoll-Paque後の細胞数</td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> MACS分離後の細胞数</td><td> 22男</td><td> 16.5 M </td></tr><tr><td>合計イベント数（MoFlo XDP） </td><td> 30.57 M </td><td> 19.97 M </td></tr><tr><td>生存率（％） </td><td> 98.00 </td><td> 98.00 </td></tr><tr><td>リンパ球ゲート内の細胞（％） </TD&gt; <td> 17.00 </td><td> 50.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td>総細胞数</td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td>合計イベント数の％ </td><td> 0.04 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td>効率性</td><td> 88パーセント</td><td> 88パーセント</td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / 低 CD45 </td></tr><tr><td>総細胞数</td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td>合計イベント数の％ </td><td> 0.05 </td><td> 0.13 </td></tr><tr><td>効率性</td><td> 89パーセント</td><td> 87パーセント</td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 MED </td></tr><tr><td>総細胞数</td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td>合計イベント数の％ </td><td> 1.54 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td>効率性</td><td> 89パーセント</td><td> 89パーセント</td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 -ハイ / CD45 </td></tr><tr><td>総細胞数</td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td>合計イベント数の％ </td><td> 6.2 </td><td> 10.25 </td></tr><tr><td>効率性</td><td> 91パーセント</td><td> 90パーセント</td></tr></tbody></table> 表1。代表的な細胞ソート統計。行1-5は、臍帯血機能により提供される回数です。残りの行は、我々の研究室で収集したデータです。貧しいソートは破片やリンパ球ゲート内の細胞の割合が低いの高いレベルが含まれていました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> ふぃぎゅRE 1。手順のフローチャート。臍帯血が処理され、単核細胞をFicoll-Paqueプラスを使用して隔離されています。追加の洗浄工程が汚染血小板を除去するために含まれています。 B細胞をMACSヒトB細胞単離キット（B-CLL）を使用して単核細胞から分離されています。このステップでは、すべての非B細胞を除去するためにビオチン標識モノクローナル抗体（CD2、CD4は、CD11b、CD36、抗IgE及びCD235a）を使用しています。回収されたB細胞は、その後前駆B細胞サブセットを回復するMoFloのXDPフローサイトメーターを使用してソートされたCD34-PEおよびCD45-FITC抗体、CD19-APCで標識されています：CD19 + / CD34 +、CD19 + / CD34 - / 低 CD45 、CD19 + / CD34 - / CD45 MED、およびCD19 + / CD34 -ハイ / CD45。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> 図2。ポップアップを識別し、ソートするためのゲーティング戦略警告事項。赤い矢印は後続のプロットに適用されるゲートを示す。 R4、R5、R6及びR7ゲートはソート集団を示しています。）フォワード対濃縮リンパ球集団を示す側面散布図。 R1は、リンパ球ゲート。単一細胞対ダブレットを識別するための前方散布図のb）の高さ対幅。 R2は、単一セルゲートますc）CD19-APC抗体陽性細胞は、CD34-PE陰性と陽性の集団に分類されます。 R3は、CD19 + / CD34 -ゲート、R4、CD19 + / CD34 +ゲートを示す希望するソート人口d）は 、CD19 + / CD34 -細胞は3多少異なるCD45-FITC集団に分類されます。 R5とR6、CD19 + / CD34 - / CD45 低およびCD19 + / CD34 - / CD45 MED集団であった。 CD19 + / CD34における高いため細胞数のR7、 - / CD45 高い人口は、この種のゲートのみ包含人口の部分。この集団のすべての細胞は、下流の分析のために収集する必要はありません。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> 図3。）カラム濃縮した後に破片を汚染の低レベル。 R1は、リンパ球ゲートますb）カラム濃縮した後に破片を汚染の高レベル。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> 図4。前駆B細胞のサブセットからのメチル化DNAの濃縮は前駆B細胞サブセットから単離された）超音波処理したDNAは高品質である。ライブラリー構築のためのDNAは、200から600 bpの平均を超音波処理する。レーン1：プロメガ100bpラダー（カタログ番号G2101）、レーン2：CD19 + / CD34 +細胞から単離した全DNA、レーン3：CD19から単離した全DNA + </sアップ&gt; / CD34 - / CD45 低細胞;レーン4：CD19 + / CD34から分離された100 ngのDNA - / CD45 MED細胞 ;レーン5：CD19 + / CD34から分離された100 ngのDNA - / CD45 high細胞。 DNAは9分（; 30秒ON、OFF 30秒）の合計の高さのDiagenode社のBioruptorを使って超音波処理した。 DNAはカラム精製し、SYBRグリーン核酸ゲル染色を用いて1％アガロースゲル上で可視化したb）のミラActivMotif MethylCollectorウルトラキット、SLC25A37によるPCR（1-6）とAPC1（7-12）を使用した後は、確認するために実行されるメチル化DNAの濃縮。 1＆7：超音波処理したゲノムDNA（無MIRA）; 2＆8：MIRA-CD19 + / CD34 +細胞、DNA、3＆9：MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 低 DNA; 4＆10：MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 MED DNA; 5＆11：ミラ-CD19 + / CD34 - / CD45の高い DNA、6＆12：水の制御。 SLC25A37の高い増幅がメチル化DNAの濃縮を確認前駆B細胞のサブセットインチ

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Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

ここでは、臍帯血から前駆体のサブセットB-細胞を単離するためのプロトコルを記述します。核酸の十分な量と質を細胞から抽出したDNAまたはRNAを利用して、その後のアッセイに使用することができる。

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K ビュー.  University of Missouri-Columbia. ここでは、臍帯血から前駆体のサブセットB-細胞を単離するためのプロトコルを記述します。核酸の十分な量と質を細胞から抽出したDNAまたはRNAを利用して、その後のアッセイに使用することができる。

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

補体の枯渇により特定の細胞集団の枯渇

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

免疫・感染学

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

マウス腹腔細胞の分離

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, antiherpetic prophylaxis is administrated systematically to pediatric UCBT recipients to prevent complications associated with VZV infection, but there is no strong, evidence based consensus that defines its optimal duration. Because T cell mediated immunity is responsible for the control of VZV infection, assessing the reconstitution of VZV specific T cell responses following UCBT could provide indications as to whether prophylaxis should be maintained or can be discontinued. To this end, a VZV specific gamma interferon (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay was developed to characterize IFN-&#947; production by T lymphocytes in response to in vitro stimulation with irradiated live attenuated VZV vaccine. This assay provides a rapid, reproducible and sensitive measurement of VZV specific cell mediated immunity suitable for monitoring the reconstitution of VZV specific immunity in a clinical setting and assessing immune responsiveness to VZV antigens. &#160;

Novel generations of functional assays such as gamma interferon (IFN-&#947;) ELISpot, which detect cytokine production at the single cell level and provide both quantitative and qualitative characterization of T cell responses can be used to assess cell-mediated immune responses directed against varicella zoster virus (VZV).

臍帯血移植後の水痘帯状疱疹ウイルス特異的細胞性免疫を評価するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...