このプロトコルは、トランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫を使用して、腫瘍異種移植片血管化のインビボ定量アッセイを提供する方法を記述する。これまでの技術に比べてこの技術の主な利点は、研究者が異種移植片血管化のレベルの変化を正確に定量できることです。重要なステップは、腫瘍細胞がゼブラフィッシュの幼虫に正しく注入され、その後のイメージングと定量ステップが損なわれないようにすることです。
B16-F1細胞を蛍光色素で増殖し標識した後、移植のための胚の準備を開始します。35ミリメートルの皿にE3溶液の2%メチルセルロースを皿の体積の4分の1に満たします。移管ピペットを使用して、約50個の前に調製したトランスジェニック胚をメチルセルロースに配置し、転写されたE3溶液の体積を最小限に抑えます。
マイクロキャピレットチップを使用して、胚が頭を上に向け、尾を底に、胚を左側に上にして垂直に向くように配置します。50%ECMを前に調製したB16-F1細胞ペレットに加え、2対1の比率でECMに細胞の混合物を生成する。ピペットと攪拌でよく混ぜ、氷の上に保存します。
マイクロキャピラリーピペットを使用して、最大3〜10マイクロリットルの細胞を取ります。事前に準備したマイクロインジェクションニードルにピペットチップを慎重に挿入し、B16-F1マトリックス混合物を針の端に排出します。針ホルダーに針を挿入し、皿に45度の角度で傾けます。
ピンセットを使用して針の先端を壊し、細胞を絞らずに針から排出するのに十分な大きさの穴を作ります。注入装置に取り付けられた加圧エアシリンダーをオンにし、一時的に連続モードでインジェクターを1秒以下にして、細胞を針の先端に押し込みます。卵子を胚の黄身嚢に向け、卵黄嚢の先端が黄身嚢から出てきて胚側の胚表皮を心臓に押し込むまで、葉嚢嚢を腹側方向に押し込む。
慎重に、わずかにそれが表皮と黄身嚢膜の間に小さなスペースを作成するまで、針の先端を前方に押し出します。インジェクターをパルスして、細胞混合物の一部をこのペリビテリン空間に排出します。異種移植片の大きさ、形状、位置を注意深く見て、正しく移植された異種移植片を確保するために針のパルス数と位置を調整します。
500〜800細胞がペリビテリン空間に注入されるまでパルスを繰り返し、黄身嚢の底に沿って少なくとも半分の道を伸ばす目に見える膨らみを作り出す。胚から針を取り出します。すべての胚を注入した後、マイクロキャピラリーピペットチップを使用してすべての胚を押し合い、できるだけ少ないメチルセルロースで配管することができます。
PTUおよびメチレンブルーを有するE3を含む回復皿に胚を移す。その後、胚の周りに静かにピペットE3を洗浄し、摂氏34度でインキュベートします。次に、共焦点顕微鏡を用いて画像麻酔胚を用いた。
腫瘍細胞に適したレーザーチャネルを使用して、画像化する体積を決定し、移植片の両側の少なくとも1つまたは2つの光学セクションを可能にする。Z スタックを作成するには、約 5 マイクロメートル離れた断面間隔を使用します。2チャネルイメージングを使用して、血管と腫瘍異種移植片の両方を画像化します。
腫瘍異種移植片と血管を1つの幼虫に画像化し、画像化する各幼虫についてこれらのステップを繰り返す。ゼブラフィッシュ異種移植片に対する血管新生応答の定量化から始めて、腫瘍異種移植片のZスタック共焦点画像ファイルを3D画像解析ソフトウェア上の新しいフォルダに転送する。腫瘍異種移植片の体積を測定するための腫瘍体積プロトコルを作成するには、ウィンドウの上部メニューの[測定]タブに移動し、表示されるプロトコルのリストから「オブジェクトを探す」というプロトコルを「ドラッグタスクを測定する」というタイトルのスペースにドラッグします。
このプロトコルが腫瘍チャネル内のオブジェクトを測定するように設定されたら、プロトコルのリストから「クリップからROIへ」と「作成からROIを作成」というプロトコルをドラッグして「ドラッグタスクを計測する」スペースにドラッグし、これら2つのコマンドが「オブジェクトの検索」で識別されるオブジェクトに適用されるようにします。このプロトコルの設定を調整する前に、ウィンドウの左上にあるモードラベルの上にあるドロップダウンメニューに移動し、拡張フォーカスビューを選択します。右端のペインの非腫瘍チャネルの選択を解除するには、各チャンネル見出しの下にある黒い円をクリックして腫瘍チャンネルのみを表示します。
次に、ウィンドウの上部にあるフリーハンドツールを使用して、すべての腫瘍体積の周囲に関心のある領域(ROI)を描画します。イメージの下のパネルで[概要]ラベルを選択し、[表示]オプションを設定して、人口 2 を表示します。調整するには、[オブジェクトの検索] タスクでアスタリスクをクリックして設定ウィンドウを開きます。
強度を使用してしきい値を調整し、バックグラウンド蛍光ではなく腫瘍細胞のみが選択されるまで下限閾値を決定します。最小オブジェクト サイズを 100 立方マイクロメートルに設定して、セルデブリの小さな項目とは対照的に、無傷のセルだけが測定されるように最小のオブジェクト サイズを決定します。上部メニューの[測定値]タブをクリックし、[プロトコルの保存]をクリックして、このプロトコルを腫瘍ボリュームとして保存します。
すべての異種移植片を測定する場合は、同じ設定を使用します。異種移植片に関連する血管の体積を測定するには、トップメニューに移動し、[測定]タブをクリックして[クリアプロトコル]をクリックして、新しいプロトコルを作成します。「オブジェクトを検索」タスクと「ROI にクリップ」タスクを「ここにタスクをドラッグしてこのプロトコルの測定を行う」というタイトルのスペースにドラッグします。
最初のコマンドが血管チャネル内のオブジェクトを測定するように設定され、最初のコマンドで識別されるオブジェクトに適用されるように次のコマンドが設定されていることを確認します。その後、血管のみを見ることができるように、極右のペインで非血管チャネルの選択を解除します。前述の腫瘍容積プロトコルと同様の方法で血管容積プロトコルの設定を決定し、このプロトコルを容器容積として保存します。
プロトコルをクリアし、異種移植片の周りにROIを描き、非腫瘍自家蛍光を含めないように注意してください。この ROI 内の腫瘍チャネル内のオブジェクトの体積の合計を測定するには、[測定値] タブをクリックし、[プロトコルの復元] コマンドを選択して、[腫瘍ボリューム] プロトコルを選択して、[復元] をクリックします。腫瘍体積プロトコルによって作成された新しい ROI を使用して、「測定」タブをクリックし、「復元プロトコル」コマンドを選択し、「船舶ボリューム」プロトコルを選択して、合計行をクリックして、このROI内の容器チャネル内のオブジェクトの総体積を計算します。
血管容積を腫瘍体積で割り、その答えを100で乗算して、移植片血管化のパーセンテージ値を得る。移植後6時間、24時間、48時間で個々の異種移植片をイメージングすることにより、異なる時点での血管新生応答を計算することができ、移植後24〜48時間の間の最大血管形成応答と約48時間の移植片血管化の最大レベルを有する。受精後2日間のゼブラフィッシュ胚に移植されたB16-F1異種移植片の共焦点的タイムラプスイメージングは、異種移植片を通じて成長するGFP標識血管を示し、哺乳類腫瘍に見られる異常な血管ネットワークの典型的な不規則な大きさおよび形態の血管を有するねじれネットワークを形成する。
VEGFR阻害剤でインキュベートされた異種移植片は、DMSOでインキュベートされた異種移植片の対照と比較して、大きな血管減少を示す。対照胚では、異種移植片領域全体にわたって伸びる広大な血管ネットワークがあり、典型的な血管形成応答はB16-F1細胞の移植後に観察された。定量化した場合、血管形成応答は、コントロールと比較した場合にVEGFR阻害剤処理異種移植片における移植片血管化の明確な減少を示す。
腫瘍チャネルは、自己蛍光を示す黄身嚢の下に蛍光標識されたB16-F1細胞の塊を示す。したがって、ROIは、卵黄嚢からの自己蛍光を含めないように注意して、異種移植片の周りに慎重に描かれなければならない。腫瘍体積プロトコルは、ROI内のすべてのB16-F1細胞を同定し、その体積を測定し、ROIをその体積に切り取った。
この新しいクリップされたROIの腫瘍容器容積議定書はB16-F1細胞の質量に関連付けられているすべての容器の識別を可能にし、それらの容積を測定した。腫瘍容積および腫瘍血管容積議定書からの値は、移植片の血管化の尺度を与えるために使用することができる。ゼブラフィッシュの遺伝的な難解性と透過性は、腫瘍血管新生における高いシグナル伝達経路の調査を可能にし、抗血管新生化合物を同定するためのスクリーニングプラットフォームとしても機能することができる。
