TGF-βファミリーのメンバーの研究は、がんゲノム解析センターオランダでサポートされています。シジア・リューと江漣はライデン大学の研究の4年間の中国奨学金委員会によってサポートされています。私たちは、MCF10A細胞株のために博士フレッド・ミラー（バーバラ・アン・カルマノス癌研究所、デトロイト、MI、USA）を感謝します。

トランスジェニック蛍光ゼブラフィッシュのTg（FLI：EGFP）を使用して、すべての研究緑色蛍光タンパク質（EGFP）を増大した株は、住宅や実験を含む、血管系20を標識は、国際的なガイドラインに従って行ったと地元の制度委員会によって承認されましたライデン大学医療センターの動物福祉（DIER Ethische Commissie（DEC）のために。 注：胚の収集（ 図1A）、マイクロインジェクション（ 図1B）、スクリーニング（ 図1C）、及び分析（ 図1D）。 図1にまとめたように、プロトコルは、大きく4つのステップに分解されます。 1.注射針を準備<ol><li>ホウケイ酸ガラスマイクロキャピラリーに注射針を準備します。次の設定でマイクロピペットプラー装置にマイクロキャピラリーを入れ：空気圧、500。熱、650。 、100を引きます。速度、200;時間、これらは、注射のために使用されるまで40針ホルダプレートに注射針を保ちます。 </li></ol> 2.注射用蛍光灯、遺伝的に標識乳癌細胞を準備します<ol><li> 100ペニシリン - ストレプトマイシン（ペニシリン - ストレプトマイシン）：L-グルタミン、10％ウシ胎児血清、および1を含むDMEM高グルコース培地中で37℃で培養ヒト乳癌MDA-MB-231細胞。 </li><li>培養5％ウマ血清、20ng / mlの上皮増殖因子、の10mg / mlのL-グルタミンを含むDMEM / F12培地中で37℃で乳房上皮細胞株MCF10A（M1）およびMCF10A-RAS（M2）、インスリン、100ng / mlのコレラエンテロトキシン、を0.5mg / mLのヒドロコルチゾン、および1：100ペニシリン - ストレプトマイシン。 </li><li> HEK293T細胞にPLV-mCherryを、のpCMV-VSVG 21、pMDLg-RRE（GAG / POL）22、とのpRSV-REV 22プラスミドを共トランスフェクトすることによってmCherryをレンチウイルスを産生します。収穫細胞上清を-80℃でトランスフェクションし、店舗48時間後。 </li><li>私5 / mlのポリブレンの存在下で通常の培地で1：nfectレンチウイルス上清と共に24時間、30％コンフルエンスでMDA-MB-231、M1、およびM2細胞は、1に希釈しました。 </li><li>安定mCherryを発現する細胞株が得られるまで、単離された細胞クローンの増殖を可能にする96ウェルプレートに細胞を希釈することによって、単一細胞クローンを選択します。 </li><li>注射のための細胞の培養1つのT75フラスコ。 0.5％トリプシン-EDTA処理で80％コンフルエンスで細胞を採取。 1×PBS 2~3時間で細胞を洗浄。 </li><li> PBSの約200μLで細胞を再懸濁。注射の前に、以下の5時間のためにそれら4°Cで保存。 </li></ol> 3.注射用ゼブラフィッシュ胚を準備します<ol><li>ゼブラフィッシュの繁殖ペアを設定し、ローゼンらによる以前のJoveの記事に示されるように、胚を収集します。 23。 </li><li>未受精卵や胚の異常を除去することにより、0-4 HPFである胚を選択します。ペトリDISに胚を保ちます卵水（60 / mlの海の塩;〜60個の胚/皿）の完全な時間とは、28℃でインキュベートします。 </li><li> 48 HPFで細かいピンセットで胚をDechorionate。 </li><li>しかし、もう2時間よりも注射前、注射前に卵の水、約2分を含有する40μgの/ mLのトリカイン（3-アミノ安息香酸）に転送することによって胚を麻酔ありません。 注：トリカインストック溶液（4 mg / mlと、100X）7.4にpH調整して、二重蒸留水97.9 mLの1 Mトリス塩基（pHを9）の2.1 mLのトリカイン粉末400mgのように調製されます。 -20°Cの冷凍庫に保管してください。 </li></ol> 4.卵黄周囲空間にヒト乳癌細胞を注入<ol><li>注射針への細胞懸濁液の負荷15μL。マイクロマニピュレーターに針をマウントし、5〜10ミクロンの先端開口径を得るために、細いピンセットで針の先端を断ちます。 </li><li>マイクロインジェクションを実行するために、空気圧picopumpとマニピュレータを使用してください。 AdjuST 400個のセルごとに注入するpicopump。注射前に、1％アガロースを含むペトリ皿の上に細胞を注入することによって手動で細胞数を数えます。 </li><li> 10個の胚各年頃ラインナップ麻酔胚フラット、1％アガロース注入プレート上の（2-3日後に受精（DPF））。 </li><li> （ すなわち 、斜めに）針を挿入するための好ましい位置に胚を配置する注射中に手でオリエント噴射板。 </li><li>注射部位に針の先端を指し、穏やかに卵黄嚢およびゼブラフィッシュ胚（ 図2A）の周皮との間の囲卵腔に針の先端を挿入します。 </li><li>約400 mCherryを標識腫瘍細胞を注入します。卵黄嚢は、卵黄嚢への移植を避けるために破裂されていないことを確認します。 </li></ol> 5.ドキュメントにヒト乳癌細胞を注入<ol><li>私が説明するように、注射針やゼブラフィッシュの胚を準備します<html> Nプロトコルは、1,2、及び3の手順。 </li><li>ドクは、胚の背側からアプローチすることができるように45°の角度針を使用してください。 </li><li>ちょうどダクトが卵黄嚢の上に広げる始まるまで背側、及び約400細胞を注入し、ドク（ 図3A）の出発点に針を挿入します。ダクト内の容積は、パルスと卵黄嚢の後に直接膨張場合注射が正確です。 注：いくつかの連続した注射針を抽出することなく行うことができます。 </li><li>卵の水に注入ゼブラフィッシュ胚を転送します。 注：としてかなりの変動は、個々のゼブラフィッシュ胚の中に存在し、注入後の胚の死が起こり得るように、（100程度）ゼブラフィッシュ胚の比較的多数の癌細胞を注入しなければなりません。 </li><li>魚および哺乳動物細胞のための最適な温度要件に対応するために33°Cでのゼブラフィッシュ胚を維持します。 </li></ol>_title &quot;&gt; 6。注入した胚を選別<ol><li>囲卵腔注射2時間後噴射（HPI）（ 図2）における蛍光実体顕微鏡下で各魚をスクリーニングまたはドキュメントの注入（ 図2）のための2-24 HPIで胚の全てを用いて注入されることを確実にするために腫瘍細胞の同様の数。卵黄嚢のような破裂（ 図2B）、または注射などの注射エラー、（ 図3B）で胚を削除し、以下注入された細胞（ 図2Cおよび3B）を有する、または（ 図2Dおよび図3B）上記胚を取り出す閾値。文化の中で約400細胞と胚のみを保管してください。 </li><li>細胞は、すでに流通している細胞と胚を除去することにより、射出プロセス中に循環内に直接導入される可能性を排除します。また、ドキュメント質量近い細胞（ 図2dで任意胚を除去</stronG&gt;）。 </li></ol> 7.画像および転移プロセスを分析<ol><li>ワイドチップパスツールピペットを用いていくつかの麻酔胚を収集し、ポリスチレンディッシュのガラス底部に転送します。 </li><li>過剰の水を除去し、卵の水の限られた量を保ちます。髪のループツールを使用して所定の位置に胚を操作し、ガラスの上にカバーを置きます。 </li><li>水浸や長距離ドライ目標と組み合わせて倒立共焦点顕微鏡を使用してください。関心領域は、可能な限り客観的に近くなるように胚を置き。 </li><li>液体の蒸発による死亡のリスクを軽減するために、すぐに麻酔後に撮影を行います。 <ol><li>同時登録2つの撮像チャネルをマージすることにより、血管を有する細胞を注入する胚の同じ位置におけるEGFP標識血管系およびmCherryを標識した腫瘍細胞からの信号を捕捉します。 </li><li>各ゼブラフィッシュの胚のために、画像の2つの異なるセットを収集頭部と尾部から。 </li></ol></li><li>散在性細胞の数を定量化します。 <ol><li>囲卵空間注射のために、ヘッドとテール領域4,15内胚魚の体に向かって細胞塊から播種した各魚における細胞の数を数えます。領域は浮き袋の背側の上に、正面心腔の境界を越えており、泌尿生殖器の開口部を越えて尾側に。 </li><li>ドキュメントの注射のために、個々の循環（MDA-MB-231）から尾翼のコラーゲン繊維に侵入した細胞または尾造血組織（CHT）の中の細胞まとめ（M2）によって形成されるクラスタの数の数を数えますそれぞれが19をゼブラフィッシュ。 </li></ol></li><li>共焦点顕微鏡を使用して、より詳細に浸潤・転移を研究する（強く推奨）。 <ol><li>画像全体に低倍率（4Xの目標）を使用します腫瘍細胞の普及パターンの概要を取得するために、本体と。 注：高倍率（20Xと40Xの目標は）内および腫瘍周囲の血管形成および胚体内における播種細胞の正確な局在を研究するのに適しています。 </li><li>赤色蛍光で標識した移植された腫瘍細胞をスキャンするためにゼブラフィッシュ胚の血管系と543 nmのレーザーをスキャンするために488nmのレーザーを使用してください。 8〜10の手順で各胚をスキャンすることで、高品質な画像を得ます。 6回スキャンし、各ステップを平均化します。 </li></ol></li><li>それがさらなる実験のために必要な場合は慎重に卵水に戻す胚を置きます。 </li></ol> 8. 事後解析が続く分散（ANOVA）の一方向分析を用いた統計解析を実行します

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish.">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell-vascular+interface+in+transparent+zebrafish.">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li><li>Rouhi, P., Jensen, L. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).</li></ol>

著者は、開示することは何もありません。

囲卵腔とドク注射でゼブラフィッシュ胚、：ここでは、Tgは（EGFP FLI1）における乳癌細胞の浸潤性の挙動を調査するために二つの方法を説明しました。トランスジェニックゼブラフィッシュ胚に化学色素または蛍光タンパク質で標識された癌細胞を注入することにより、浸潤および転移の動的及び空間特性は、明らかに蛍光顕微鏡下で単細胞またはクラスタレベルでリアルタイ?...

クリニックでの明白な癌の転移は「転移カスケード」として知られ、複雑で多段階の一連のイベントを含みます。カスケードは広く概説されており、連続したステップに解剖することができます：局所浸潤、脈管内、普及、逮捕、血管外漏出、および植民地化1、2。癌転移の病因の理解とin vivoでの潜在的な治療戦略の開発は、癌細胞の広がりの強力なホストモデルが必要です。げっ歯類のモデルは十分に確立され、広く転移3を評価するために使用されているが、これらのアプローチは、低効率性と倫理的な限界があり、特定の操作が転移性の表現型に影響を与える可能性があるかどうかを判断するために最先端モデルとして高価です。その他の効率的な、信頼性の高い、低コストのモデルはすぐに（エピ）遺伝的変化やpharmacologの潜在的な影響へのアクセスに必要なiCalの化合物。その高い遺伝ヒトに対する相同性およびその胚のゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の透明性に重要な脊椎動物のモデルとして浮上していると、ますます発達プロセス、微生物宿主相互作用、ヒトの疾患、薬物スクリーニングなどの研究に適用されています。4。ゼブラフィッシュに設立された癌転移モデルは、齧歯類モデル5、6の欠点に対する答えを提供することができます。 自発的新生物はほとんど野生ゼブラフィッシュ7に見られないが、ゼブラフィッシュにおいて所望癌を誘発するためのいくつかの長年の技術があります。発癌物質誘発性の遺伝子突然変異またはシグナル伝達経路の活性化は、組織学的および分子モデル発癌、ゼブラフィッシュ7、8、9、ヒト疾患を模倣することができます。 TAKにより、前方多様の利点をすると、癌遺伝子または腫瘍抑制因子の遺伝子操作を逆に、（遺伝子組換え）ゼブラフィッシュまた、癌の形成と維持6、10の潜在的な研究を有効にしています。ゼブラフィッシュにおける誘導癌モデルは、消化器、生殖、血液、神経系、および上皮6を含む広いスペクトルをカバーしています。 癌研究におけるゼブラフィッシュの利用はこれによる生物におけるヒト腫瘍細胞の異種移植モデルの確立に最近拡大しています。これは、最初に成功した2005年11胞胚段階でゼブラフィッシュの胚に移植したヒト転移メラノーマ細胞で報告されました。いくつかの独立した研究室では、様々なサイトや発達段階でゼブラフィッシュへの哺乳動物の癌細胞株の多様な範囲を導入することで、この先駆的な仕事の実現可能性を検証してきた5 &lt;/ SUP&gt;。例えば、胚盤および胞胚期の胚盤胞の近くに注射します。 5日齢の胚に卵黄嚢、卵黄周囲スペース、キュビエ（DOC）のダクト、及び6-H-の後部主静脈への注射;および30日齢の免疫抑制幼虫の腹腔内への注射は、5、12を行ってきました。また、同種異系腫瘍移植もゼブラフィッシュ12、13で報告されました。異種移植片を使用しての大きな利点の一つは、移植された癌細胞が簡単に蛍光標識し、正常細胞と区別することができるということです。したがって、microtumor形成14、細胞浸潤および転移15、16、17、腫瘍誘導血管形成15、1の動的挙動の調査8、および癌細胞とホスト間の相互作用は、トランスジェニックゼブラフィッシュの行は5に適用されている場合は特に、17は明らかに生きた魚の体に可視化することができる要因。 ドク注射〜16ゼブラフィッシュの胚：転移を評価するために、ゼブラフィッシュ異種移植モデルの高電位に触発され、我々は、Tgは（EGFP FLI）の尾翼領域に異なる乳癌細胞株の経血管外遊出の性質を示しました。プロ/抗乳癌細胞の浸潤や転移におけるトランスフォーミング増殖因子βの役割（TGF-β）16と、骨形成タンパク質（BMP）19のシグナル伝達経路はまた、このモデルで検討しました。また、我々はまた、卵黄周囲スペース注射で異種移植ゼブラフィッシュモデルを使用して循環に様々な乳癌細胞株の脈管内の能力を再現し。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>AGAF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>300038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>227035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5 STED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose media containing L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 media containing L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21041025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>227035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>I-6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A (M1) cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10Aras (M2) cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F276456I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSVG plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLV-mCherry plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 4 software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-REV plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fli:EGFP) zebrafish strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base&#160;</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>11814273001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (3-aminobenzoic acid)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (60 &#215; 15 mm)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene dish with glass bottom</td>
			<td>WillCo</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish

多くの場合、癌患者は、原発腫瘍で死ぬのではなく、理由転移のしないでください。多数のげっ歯類モデルは、in vivoで癌転移を研究するために利用可能であるが、他の効率的な、信頼性の高い、低コストのモデルはすぐに（エピ）の遺伝的変化または薬理学的化合物の潜在的な効果にアクセスするために必要とされています。そのため、我々は説明し、この目標をサポートするために、ゼブラフィッシュの胚に注入ヒト乳癌細胞を用いた異種移植モデルの実現可能性を説明します。顕微鏡下で、蛍光タンパク質または化学的に標識されたヒト乳癌細胞は、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚に移植され、Tgは（FLI：EGFP）、48時間受精後囲卵腔またはキュビエ（DOC）のダクトに。まもなくして、生きている魚の体内の癌細胞の浸潤、普及、および転移の時間的・空間的なプロセスは、蛍光顕微鏡下で可視化されます。別の注射部位を使用したモデル、 すなわち、あたりivitellineスペースまたはドキュメントは、イベントの多段階転移カスケードの初期段階（血管内のステップ）及び後期（血管外遊出ステップ）を反映し、互いに相補的です。また、腫瘍周囲および腫瘍内血管新生は囲卵腔への注射を用いて観察することができます。全実験期間は、これ以上の8日未満です。これらの2つのモデルが、遺伝的および薬理学的操作に応じて、癌転移の迅速な評価を可能にする、細胞標識、マイクロ移植、および蛍光イメージング技術を兼ね備えています。

囲卵腔注入して胚性異種移植ゼブラフィッシュモデルでは、魚の体中の標識された癌細胞の血行性の普及を積極的移行と考えられています。上記の方法に記載のように、このプロセスは、蛍光顕微鏡下で検出および定量することができます。この異種移植モデルを説明するために、我々は、in vitroに応じて公知の（又は無し）浸潤/転移電位と異なる乳癌細胞株?...

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Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

ここでは、侵襲的な行動を調査し、それぞれ、ヒト乳癌細胞の脈管内および血管外漏出の可能性を評価するために、二つの異なる注射部位、 すなわち、卵黄周囲のスペースとキュビエのダクトを使用して異種移植ゼブラフィッシュモデルを記述します。

胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

invasive-behavior-of-human-breast-cancer-cells-in-embryonic-zebrafish

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.5K ビュー.  Leiden University Medical Center. ここでは、侵襲的な行動を調査し、それぞれ、ヒト乳癌細胞の脈管内および血管外漏出の可能性を評価するために、二つの異なる注射部位、 すなわち、卵黄周囲のスペースとキュビエのダクトを使用して異種移植ゼブラフィッシュモデルを記述します。 

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Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

顕微鏡骨転移の効率的かつ選択的モデリングのためのイントラ腸骨動脈注入

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

がん研究

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

乳がん関連リンパ浮腫の超音波評価

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

（ゼブラフィッシュにおける癌細胞の血管浸潤能をテストします<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

侵襲性外科生検に対する脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

ゼブラフィッシュにおける機能化された蛍光シリカナノ粒子を用いた異種移植ヒト癌細胞のビボ標的化

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...