ゼブラフィッシュ異種移植片は、がん研究に広く使用されています。あなたは人間の腫瘍細胞を取り、小さな幼虫ゼブラフィッシュ、あるいは大人にそれを注入することができます。ここでは、生きている動物のいくつかのヒト癌の特徴を研究することができる幼虫モデルのステップバイステッププロトコルです。
増殖を研究し、血管新生を研究し、転移を研究することができ、腫瘍微小環境内での相互作用も研究できます。そして、大きな利点は、あなたが非常に短い時間枠でこれを研究できることです。例えば、わずか4日間。
もう一つの大きな利点は、共焦点または軽シート顕微鏡を使用して、単一細胞分解能でこのライブを研究できることです。細胞がどのように移行するか、細胞が互いに相互作用するか、あるいは細胞が互いにどのように話し合うかを調べることもできます。だから、がん生物学を研究することは本当に強力なモデルです。
ゼブラフィッシュ異種移植片は、化学療法、放射線療法、さらには抗体を用いた標的療法のような抗癌療法に対する反応を研究するために使用することができる。そして最後に、このプロトコルはまた、外科サンプルから、あるいは生検から患者由来の細胞を使用するように適応し、ゼブラフィッシュのアバターを生成することもできる。注射用のセットアップ。
注射の2週間前に、培養中の細胞を拡大する。多くの細胞や魚が訓練中に失われるので、技術に堪能になるまで余分な細胞と余分な魚から始めます。付属のPDFの表1は、いくつかの細胞株の注入のためのインビトロ合流の最適な割合の詳細なガイドを有する。
注射の3日前に、所望の背景のゼブラフィッシュを横切る。注射の24時間前。ゼブラフィッシュの胚プレートをきれいにします。
すべての死んだ胚と非発達胚を捨て、E3培地をリフレッシュします。細胞培養室では、細胞培養培地を廃棄する。PBS 1Xで一度洗い、死んだ細胞を取り除き、新鮮な培地を加えます。
注射用の胚を揃えるために、マイクロインジェクション針、アガロースプレート、ヘアピンなどの注射手順用のツールを準備します。プレート調製のために、溶解した2%アガロースの1つの層をきれいなペトリ皿の蓋に注ぎます。それを重合させ、定規の助けを借りて、胚の整列のために3〜4本のまっすぐなアガロースラインを作ります。
注射日。孵化した胚を孵化していない卵から分離する。この段階で胚培地にプロナーゼを加えることは、孵化を後押しすることができる。
胚を注射まで摂氏28度でインキュベーターに入れる。注射用の細胞ラベリング。再現可能なセルラベル技法の確立を支援するために、セルラインのリストと複数のラベリングソリューションをコンパイルするために、書かれたプロトコルの表1と2をチェックします。
細胞培養培地を取り出し、PBS1Xでフラスコを2回洗う。細胞に脂溶性染料を付け、光への暴露を避け、フラスコを37度でインキュベートします。また、剥離時に1.5 mlマイクロ遠心チューブ内の細胞にラベルを付けることを選択することができます。
細胞標識液を取り出し、細胞をPBS1Xで洗浄し、過剰な染料を取り出します。対応する剥離剤を加え、セルを摂氏37度でインキュベートする。フラスコを滅菌細胞スクレーパーでブラッシングし、血清ピペットで細胞を収集することにより、剥離プロセスを容易にします。
細胞を1.5mlのマイクロ遠心チューブおよび遠心分離機に移す。上清を捨て、細胞培養培地でペレットを再懸濁する。トリパンブルー排除または他の選択方法を用いてノイバウアーチャンバーを使用して細胞生存率を定量化する。
遠心分離機を注射媒体中の細胞を再び懸濁させる。培地中の細胞の推奨濃度は、原稿の表1に記載されています。この時点以降、細胞は氷の上に保管する必要があります。
注射手順。トリカイン1Xの胚を5分間麻酔する。次に、少量の麻酔をした胚をアガロースプレートに移し、ヘアピンループの助けを借りてそれらを整列させます。
胚間の距離を維持するようにしてください。特に1の黄身と次の卵の頭の間。死亡率を防ぐために、配位置した胚が、トリケーヌ1X溶液を1~3滴慎重にプレートに加えることによってアガロースプレートで乾燥しないようにします。
マイクロ遠心チューブを軽くタップして細胞を再懸濁します。マイクロローダーチップを使用して注射針をセルサスペンションでバックロードし、胚の完全性を損なう可能性があるため、気泡を避けます。空気圧弁を開き、マイクロインジェクターを設置し、マイクロインジェクションニードルをホルダーに慎重に入れる。
マイクロインジェクションニードルを先端近くに切ります。慎重に胚の黄身を突き刺し、針の角度を下げ、針の先端がペリビテリン空間に達するまで慎重に押す。先端がペリビテリン空間に入ったら、細胞を注入する。
胚の目の大きさに似た細胞の体積を注入し、心臓浮腫を防ぐために心臓から可能な限り注入してみてください。必要に応じてマイクロインジェクターの圧力を調整します。注入した胚をトリカイン1X溶液できれいなペトリ皿に移し、5〜10分間休ませます。
これは、傷を閉じる時間を与えます。トリケーヌ1X溶液を取り除き、新鮮なE3培地を加えます。その後、胚を摂氏34度でインキュベートする。
この温度は、ゼブラフィッシュ胚とヒト腫瘍細胞の両方の生存を可能にする。転移アッセイ。細胞株の転移電位を研究したい場合は、注入後約1時間で、注入された胚を蛍光立体顕微鏡でスクリーニングし、循環する癌細胞の不在または存在に応じて2つのグループに分類する。
1日の注射後。蛍光体顕微鏡では、各胚を注意深く分析し、適切に注射された腫瘍を持つものを選択します。腫瘍サイズに応じて選択した異種移植片を並べ替えます。
比較には目の大きさを使用します。異常な形態、心臓または黄身浮腫、癌細胞が非常に少ない異種移植片、または卵黄の中にのみ癌細胞を持つ胚を捨てる。所望の実験レイアウトに従って異種移植片を配布し、薬物アッセイを開始する。
毎日薬とE3培地を交換してください。異種移植片をインキュベートし、アッセイの終わりまで摂氏34度の温度を維持する。注射後4日間。
アッセイの最終日に、異種移植片をトリカイン1X溶液で麻酔し、寒天板に慎重に位置合わせします。死んだ、または腫れた異種移植片を捨てる。これらの異種移植片は、生着定量のために考慮されていません。
蛍光体顕微鏡では、各異種移植片を注意深く分析し、ペリビテリン空間における腫瘍の存在または存在を評価する。実験のセットアップによると、目的の異種移植片を選択し、トリカイン25Xでそれらを安楽死させる。4%ホルムアルデヒドを室温で少なくとも4時間固定し、免疫染色を進めます。
それ以外の場合は、摂氏4度で一晩保存し、翌日にホルムアルデヒドを100%メタノールに置き換えます。100%メタノールに固定された異種移植片は、20度無期限に保存することができる。共焦点イメージングのための全体マウント免疫染色。
全体のマウント免疫蛍光技術は、次のように分割して、3日間かかります。最初の日は、異種移植片および一次抗体インキュベーションの透過性化のためです。2日目は、洗浄および二次抗体インキュベーションに対する。
そして3日目は、洗浄のために、異種移植片の固定および取り付け媒体中の貯蔵を行う。この手順の詳細については、付属の PDF を参照してください。異種移植片の取り付け。
取り付け媒体が漏れないように、カバースリップの端を石油ゼリーまたはシリコーングリースで密封します。パスツールピペットを使用して、異種移植片をカバースリップに移します。慎重にヘアピンでそれらを整列させます。
取り付け媒体を別のカバースリップに追加します。慎重に両方のカバースリップを結合し、より簡単な操作を可能にするために顕微鏡のスライドの上に置きます。共焦点イメージング。
水補正を伴うアポクロマティック25X浸漬対物レンズは、単一細胞分解能を有する腫瘍のイメージングに最適です。Z-Stack 関数を使用して、各スライス間に 5 ミクロンの間隔でサンプルを取得します。フィジーのソフトウェアで生データを開きます。
ゼノ移植片ごとに、zスタックごとに、上、中央および下から腫瘍の3つの代表的なスライスを選択する。フィジーのソフトウェアからセルカウンタープラグインを開きます。セル カウンタ ツールで、[初期化] をクリックし、カウンタ の種類を選択してイメージをクリックし、カウント モードを手動で開始します。
クリックするたびに、カウンタはカウントされるセルの数を尋ねます。腫瘍内の細胞の総数を得るために、以下の式を用いた。免疫細胞、有糸分裂性の数値、活性化カスパーゼなどのマーカーの総数または割合を評価するには、セルカウンタープラグインを使用してZスタックのすべてのスライスに沿って、特定のラベリング、マーカーまたはトランスジーンの関心のある細胞を手動で定量化します。
一部のセルは 2 つのスライスの間に配置されます。z スタックを行ったり来たりして、セルが 2 回カウントされないようにします。代表結果。
HCT 116大腸癌細胞株異種移植片は、プロトコルに記載されるように生成した。異種移植片は、非治療コントロールおよびFOLFIRI化学療法において無作為に分布した。免疫蛍光をアポトーシス細胞を検出するために、抗切断カスパーゼ-3抗体およびDAPIを用いて核酸対抗染色を行った。
有糸分裂指数の定量化、アポトーシス、および腫瘍サイズは、FOLFIRIが有糸分裂の有意な減少およびアポトーシスの有意な誘導を誘発し、腫瘍サイズの54%の減少を伴うことを明らかにした。これらの特徴は、ハイスループット表現型の薬物スクリーンにおいて有用であるとともに、短時間で複数の癌治療の細胞固有および生理学的効果をテストする。ゼブラフィッシュ異種移植モデルのもう一つの大きな利点は、異なる腫瘍細胞の相互作用を研究し、各タイプの細胞が他の細胞の挙動にどのように影響するかを分析することができるということです。
異なるヒト癌細胞は、同じ腫瘍から、または異なる腫瘍から異なるクローンを、共注射することができる。この例では、同じ患者由来の2つの大腸癌細胞株を異なる親油性染料で標識し、注射のための1対1の比率で混合した。このプロトコルが、研究者がゼブラフィッシュ異種移植片を生成する真の専門家になることを願っています。
それは簡単ではありません。練習する必要があります。諦めないで下さい。
きっとそこに着くと思いますよ。がんばって。
