このプロトコルは、脊髄再生の分子機構の研究のために、アキソロテル脊髄神経幹細胞における迅速かつ高度に貫通する時間および空間制限遺伝子ノックアウトを可能にする。この技術は、神経幹細胞における遺伝子機能の研究を可能にし、その医学的再生は、他の細胞型の発達効果または効果によって混乱することなく。アキソロテル神経幹細胞は、脊髄を再生する能力に大きく貢献しています。
再生メカニズムを理解することは、ヒト脊髄損傷の治療法を開発するための洞察につながる可能性があります。この方法は、アショロテル神経幹細胞が脊髄損傷に対する再生応答をどのように取り付けるかについての洞察を提供する。注射毛細血管を脊髄中央列に正しく配置することは困難であり、試験動物に練習することは、技術を習得するのに役立ちます。
投与を見ると、注射の実行方法と、正常な注射がどのように見えるかを示すことができます。Cas9ガイドRNAリボ核タンパク質混合物を調製するには、Cas9核局在配列タンパク質の5マイクログラム、ガイドRNAの4マイクログラム、および10X Cas9バッファーの0.9マイクロリットルを混合します。その後、ヌクレアーゼフリー水で総体積を10マイクロリットルにし、Cas9ガイドRNAリボ核タンパク質混合物をマイナス80°Cですぐに使用しない場合は、摂氏80度で保存します。
アガロースエレクトロポレーションプレート調製の場合、ダルベッコPBSで2%アガロースの200ミリリットルを調製し、混合物を電子レンジで溶解する。わずかな冷却の後、液体アガロースを約10ミリメートルの深さまで10センチメートルのペトリ皿に注ぎ、プレートを室温で固めます。アガロースが触れるにしっかりしている場合は、手術用メスを使用して、尾をまっすぐに保持するための各皿のアガロースのスリットをカットし、動物の体にフィットする井戸、電極を保持するための2つの余分な井戸を使用します。
その後、氷の上にプレートを置き、氷冷DPBSでリムにそれらを埋めます。エレクトロポレーターを構成するには、70 ボルトの 1 つのバイポーラパルスにポーリングパルスを設定し、時間は 5 ミリ秒、間隔は 50 ミリ秒、電圧減衰なし。転送パルスを40ボルトの4つのバイポーラパルスに設定し、持続時間は50ミリ秒、間隔は999ミリ秒、電圧減衰は10%です。
次に、電極をエレクトロポレーターに接続し、ピンセットを7ミリメートル離れた後に調整してから、PBSのビーカーに電極を浸します。ガラスマイクロ注入毛細血管を準備するには、メーカーの指示に従ってマイクロピペットプーラーでランプテストを行い、熱値を決定します。次に、指示されたパラメータでテーパードエンドで注射毛細血管を引っ張ります。
引っ張った後、ステレオ顕微鏡と細かい鉗子を使用して毛細血管を斜めで割り、先端がアショロテル脊椎の中央運河を標的にするのに十分な薄さの位置に傾斜した先端を持ち、皮膚を突き刺すのに十分な強さを残します。先端をロードする前に、1〜30の比率でリボ核タンパク質混合物に速緑色のFCF溶液を加え、ゲルローディングピペットチップを使用して約5マイクロリットルの注入ミックスを毛細管にロードします。次に、傾斜した先端を下向きにして、空気圧ポンプにキャピラリーを取り付けます。
空気圧ポンプを構成するには、ホールドを1平方インチあたり0.5ポンド、1平方インチのホールドあたり2ポンドに、ゲートする持続時間に設定します。毛細管とポンプの設定をテストするには、キャピラリーを水滴に浸し、フットペダルを押して注入します。注射ミックスは、ゆっくりと安定した流れで出てくるはずです。
リボ核タンパク質混合物を注入するには、水中に逆さまに注入されるaxolotlsを反転させて沈降を確認し、リング鉗子を使用して1匹の動物をシリコーンのベッドに移し、動物の左側を上に向け、尾を右を指します。射出部位をステレオ顕微鏡の視野の中央に配置し、毛細管が視野の右側から60度の角度で動物に入るようにマイクロマニピュレーターを調整します。脊髄と中央運河を特定した後、毛細血管を脊髄の中央運河に向かってゆっくりと動かし、皮膚と筋肉を穏やかに突き刺す。
毛細管が位置したら、足のペダルを押し下げて中央運河に混合物を注入します。毛細管が適切に配置されていれば、リボ核タンパク質混合物は中央運河に沿って青色の線として両方向に広がります。毛細血管を正しく配置するのは難しい場合があります。
混合物が正しく広がらない場合は、フットパッドを押したまま、小さなステップでキャピラリーの位置を調整します。混合物が脊髄の端部の小胞および脳の心室に達するまで足のペダルを押し続ける。射出中に吐出圧力を調整する必要があるかもしれません。
注射の直後に、リング鉗子を使用して、準備されたアガロースエレクトロポレーションプレート上の動物を氷の上に移し、尾をスリットの内側に置き、アガロースに挟まれるようにします。尾の両側の井戸に電極を入れ、動物と電極全体が氷冷PBSで覆われているのを念こみ、足スイッチを押してエレクトロポレーションを開始します。次に、完全な回復までモニタリングして動物を水に戻し、同じ方法で後続の動物を注入し、電気ポポレートします。
ノックアウトの効率をタンパク質レベルで評価するには、尾部の断面を取得し、標準プロトコルに従って免疫体系解析を行います。あるいは、電気ポレートされた脊髄を抽出し、サンプルを分解してDNAを得る。次に、遺伝子型入力 PCR を実行し、続いてサンガーシーケンシングまたは次世代シーケンシングを実行して、編集された遺伝子座の割合を評価します。
Cas9ガイドRNA複合体のアショロテル脊髄中央管へのAsx2に対する注入およびエレクトロポレーションは、脊髄神経幹細胞の大部分におけるSox2免疫反応性の大規模な損失をもたらし、Cas9ガイドRNA複合体をチロシナーゼに対する注射およびエレクトロポレーションと比較した。脊髄組織部サンプル中のSox2陽性細胞の定量化は、Cas9 Sox2ガイドRNAエレクトロポレーションノックアウト動物におけるSox2発現細胞の数を有意に減少させることを明らかにし、この方法が脊髄神経幹細胞における効率的で高度に貫通する遺伝子ノックアウトにつながることを示している。Sox2とGFPに対する2つのCas9ガイドRNA複合体を、ユビキタスGFP発現を有するトランスジェニックアクソロTLSに同時に注入およびエレクトロポレーションした後、二重ノックアウト神経幹細胞の高い割合が観察され、プロトコルを使用して複数の遺伝子を柔軟にノックアウトできることを示している。
毛細管で中央の運河をターゲットにして練習し、注入が期待どおりに動作しない場合のトラブルシューティング手順を使用して式を置くのが役立ちます。この技術により、神経幹細胞の遺伝子の機能を再生に特異的に研究することができます。毛細血管を操作する際は注意し、自分の指を刺さないようにしてください。
