CRISPRベースのゲノム編集ツールは、遺伝子操作されたREPモデルの作成を大幅に促進しました。CRISPRシステムは、Cas9ヌクレアーゼに対する単一のガイドRNA複合体で構成されており、ゲノム内の目的の配列を標的にして二本鎖DNA切断を作成するようにプログラムすることができます。DNA修復テンプレートの同時送達により、このDNA切断は、ホモロジー指向性修復と呼ばれるプロセスを通じて、任意の操作されたDNA配列の付加とともに正確に復元することができます。
このプロセスにより、標的DNAの挿入または置換を含むノックインラットモデルを作製することができます。このプロトコルを用いて、アデノ随伴ウイルスを用いてラット胚にDNA修復テンプレートを送達し、その後、2細胞胚エレクトロポレーションによるCRISPR Cas9複合体を送達する修正アプローチを紹介します。AAV血清型1または6は、CRISPRを介した相同性指向性修復プロセスを通じてラットゲノムに組み込まれるように設計された、遺伝子操作されたDNA修復テンプレートでパッケージ化されています。
AAVは、30マイクロリットルのラットKSOM培地に、マイクロリットルあたり7番目のゲノムコピーまでの最終濃度3 X 10で添加されます。次に、前核が見える1細胞期の胚を採取し、AAVを含む培地に移し、ウイルスの形質導入を促します。当社のプロトコルを使用すると、AAV血清型1および6が効率的なDNA修復テンプレート送達のために容易に通過できるため、透明帯を薄くする必要はありません。
胚は、5%の二酸化炭素と最大湿度で摂氏37度でAAVで一晩培養されます。翌日、1マイクロリットルあたり100ナノグラムのシングルガイドRNAと、1マイクロリットルあたり100ナノグラムのCas9タンパク質をOptiMIM培地で希釈したエレクトロポレーション混合物を作製します。混合物を室温で10分間インキュベートし、CRISPR RNP複合体を形成させます。
インキュベーション時間中に、エレクトロポレーターをオンにし、スライドガラス電極にリード線を取り付けます。RNP形成が完了した後、溶液に気泡が入らないように注意しながら、5マイクロリットルのエレクトロポレーション混合物を電極間にピペットで移します。2細胞段階にある胚は、AAVを含む培地から取り出され、電極間のエレクトロポレーション混合物に慎重に移動されます。
胚は整列し、エレクトロポレーション中に溶解を引き起こすため、どちらの電極にも触れないようにします。これは、顕微鏡で見たこの手順のビューです。また、電極間の体積が大きくなるとインピーダンスが減少することにも注意が必要です。
このため、エレクトロポレーション混合物を希釈しないように、胚と一緒に最小限の培地を移植する必要があります。次に、オーム記号の付いたボタンを押してインピーダンスを測定します。インピーダンスは0.18〜0.3オームの範囲内である必要があります。
範囲内にある場合は、スタートボタンを押すことでエレクトロポレーションが開始されます。このプロセスは数秒しかかからず、顕微鏡で見るとこんな感じです。各電極に気泡が急速に形成されていることに気付くでしょう。
エレクトロポレーションの直後に、スライドガラスから胚を採取し、新鮮なラットKSOM培地で3回洗浄します。その後、胚をin vitro研究のために培養したり、代理母の雌に移植して生きた子孫を産出したりすることができます。エレクトロポレーション後の胚の腫脹は一般的であることに注意することが重要です。
この腫れは、培養で数時間後に治まるはずです。また、エレクトロポレーション後の2つの細胞胚の最大20%で細胞融合イベントが見られることも一般的です。細胞融合は、典型的には、電極間の胚の注意深い水平軸位置合わせによって回避することができる。
ラット胚でプロトコルをテストし、培養芽球をスクリーニングして、2つのloxP部位を含む操作された短い人工イントロン配列を挿入します。胚盤胞の60%以上が、次世代の配列解析に基づいて正しく標的を絞ったノックイン対立遺伝子を含んでいることに気づきました。次に、生きたノックインラットを作製するためのプロトコルをさらにテストし、ラットDRD2遺伝子のATG開始部位を標的とするCreリコンビナーゼコーティングシーケンスをエンジニアリングするプロジェクトを設計します。
生まれた11人の子孫のうち、10人は、5つのプライムホモロジーアーム、3つのプライムホモロジーアーム、およびCreリコンビナーゼを検出するための内部PCRアッセイにわたるPCR分析によって陽性でした。7つの異なるプロジェクトの概要として、ホモロジーアームジャンクション全体のPCR解析とDNA配列検証によって決定された創始動物の平均ノックイン成功率76%を達成しました。このAAVを介したDNA送達と2細胞胚エレクトロポレーションパイプラインを使用することで、最大3KBの長さのDNA挿入において、従来のアプローチよりも大幅に高いノックイン効率を実現しました。
また、ラットの胚でこの手順の使用を実証しましたが、標的DNA挿入を生成するために他の種にも効果的に適用できる可能性があることに注意することも重要です。
