本ビデオでは、ラット脳ミトコンドリアをインビトロ生物学的モデルとして用いた膜レベルでのアミロイド毒性のメカニズムに関するモデル研究について説明する。リン脂質モデル系におけるアミロイド集合体による膜摂動のメカニズムを記述した報告を蓄積したにも関わらず、生物学的膜の開発から始まる事象を直接標的に研究した。本ビデオでは、ラット脳ミトコンドリア膜をインビトロ生物学的モデルとして分析するα-シヌクレインのアミロイド線維について説明する。
ミトコンドリアは、よく特徴づけられている膜を有するオルガネラとして、神経変性疾患に関連する膜レベルでのアミロイド細胞傷害のメカニズムに関連する分子研究に極めて有用な生物学的モデルシステムを提供できると考えています。小動物ギロチンでラットを切断し、ミトコンドリアの特性の可能性のある悪化を制限するために、ラットの切断から1分以内にスケールから脳を取り除きます。迅速に作業し、手順を通じて氷の上にすべてを維持することが重要です。
30ミリリットルの分離バッファーで組織を 2 回洗浄します。冷たい分離バッファーを含むビーカーに移し、はさみで脳を細かくミンチします。20ミリリットルのコールドダンスホモジナイザーに組織懸濁液を移す。
電動の害虫で9つの上下のストロークを使用して組織片を均質化します。3つの均質化ストロークの各セットの後、約30秒間氷の上に混合物を残して、ホモゲントが冷たく保たれるようにします。ホモジュネートを4°Dで1,300Gの予冷遠心管と遠心分離機に3分間移します。
上清を慎重にデカントし、冷やした遠心分離管に移します。4センチで21,000Gで遠心分離機を10分間行う。上清を捨て、ピペットで混合物を穏やかに攪拌することによって密度勾配媒体中のペレットを再懸濁する。
固定角ローターで固定角度ローターで遠心分離機を30,700Gで4°グレードで5分間用いた。パスツールピペットを使用して、主にミエリンを含む上部に蓄積された材料の鋭い端を取り除きます。ミトコンドリア分画に8ミリリットルの分離バッファーを加え、ピペットで混合物を穏やかにかき混ぜます。
遠心分離機は16、700Gで4セングレードで10分間。上清を慎重に取り除き、底の緩いペレットを邪魔しません。ピペットの先端で混合物を穏やかにかき混ぜながら遠心管に1ミリリットル10ミリグラムを遠心管に加えます。
分離バッファーを追加して、体積を 5 ミリリットルにします。遠心分離機は6、900Gで4セングレードで10分間。これはしっかりしたペレットを生成する必要があります。
上清をデカントし、ミトコンドリアペレットを分離緩衝液で静かに再懸濁する。ミトコンドリアホモジュネートを冷たい分離バッファーで1ミリリットル当たり1ミリグラムにし、2つの1.5ミリリットルチューブ(通常は1管当たり195マイクロリットル)に入れます。最大酵素活性を得るための正のコントロールとして1つのチューブに1つの体積に5マイクロリットル20%の体積トリトンX-100を加え、5マイクロリットル脱イオン水を別のチューブに加えてコントロールし、続いて攪拌機と混合します。
30°Cに設定された温水浴でチューブを10分間インキュベートします。16,000G4摂定で固定角ローター中のチューブの遠心分離によるペレットミトコンドリアを15分間摂氏化した。次の部分に記載された標準的な分光光測定アッセイを用いてミトコンドリア環状トウモロコシデヒドロゲナーゼの活性を評価するために得られた上清を慎重に収集する。
ミトコンドリア膜の完全性を次のように計算する。マルレートデヒドロゲナーゼ活性測定のために、ピペット890および880マイクロリットル50ミリモルトリス-HCLバッファーは、それぞれ100マイクロリットル50ミリモルオキサセアセテートと10ミリモルβ-NADHの10マイクロリットルが続く試験キュベットをサンプリングする。キュベットを分光光度計に入れ、ブランクに対して参照します。
サンプルキュベットに1ミリリットルあたり1ミリグラムをホモジュネイト10マイクロリットルミトコンドリアを加えます。すぐに反転によって混ぜる。NADH酸化による吸光度の低下を340ナノメートルで1分間記録。
α-シヌクレインアミロイド線維化の場合、294マイクロリットルのタンパク質溶液、200マイクロモルを各1.5ミリリットルチューブに加えます。その後、6マイクロリットルThT溶液1ミリモルを追加します。溶液を混合し、800 RPMで一定の攪拌下で37摂氏でサーモミキサーでチューブをインキュベートします。
牛インスリンアミロイド線維化の場合、タンパク質溶液637マイクロリットル、1.5ミリリットルチューブに250マイクロモルを加える。その後、13マイクロリットルThT溶液を1ミリモルに加え、攪拌します。透明な底96ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルのタンパク質溶液をアリコートを加えます。
プレートを透明なシールテープで密封します。プレートを細胞化5蛍光プレートリーダーに積み込みます。30分間隔で12時間のThT蛍光を測定します。
440ナノメートルで励起を使用し、485ナノメートルで発光します。井戸を選択します。各測定の前にプレートを5秒間振ります。
温度を攪拌せずに57°Cに設定します。ミトコンドリアホモジナートを含む2つのシリーズ1.5ミリリットルチューブ、MDH放出アッセイ用の1シリーズ、ミトコンドリアROS測定用のシリーズを用意します。α-シヌクレイン、ウシインスリンまたは鶏卵白リゾチームの新鮮またはアミロイド線維のアリコートをミトコンドリアホモゲネートに加え、続いて穏やかにピペット化する。
ミトコンドリア懸濁液を含むインキュベートチューブを温水浴で30分間30°Cに設定した。マルレートデヒドロゲナーゼ放出アッセイの場合、遠心分離機はミトコンドリアホモジネートを16,000Gで15分間インキュベートした。プロトコルセクション4に記載されているようにミトコンドリアMDHの活性をアッサルトするための得られた上清を慎重に収集する。
MDHのリリースを次のように計算します。ミトコンドリアROS測定の場合、96ウェルプレートの各ウェルにインキュベートミトコンドリアホモゲネートのピペット191マイクロリットル。50マイクロモルDCFDAの4マイクロリットルを加えます。
その後、200ミリモルコハク酸塩の5マイクロリットルを追加します。30摂氏にセットされた温水浴でプレートを30分間インキュベートし、軽くかき混ぜながらおかえします。プレートをCytation 5蛍光プレートリーダーにロードし、プロトコルセクションに従って蛍光強度を測定します。
ミトコンドリア膜の完全性は、Triton X-100による膜破壊および酵素放出前後の単離されたミトコンドリアにおけるMDH活性を測定することによって評価した。ご覧のとおり、ミトコンドリア製剤は通常約93%そのままであることがわかりました。ThT蛍光アッセイはアミロイド線維の成長を監視するために行った。
3つのタンパク質のアミロイド線維化の曲線は典型的なシグモイドパターンを示し、α-シヌクレイン、ウシインスリン、鶏卵白リソチームの約96時間、12時間、96時間で高原に達し、AFM測定でより確認されたアミロイド線維の形成を示唆した。アミロイド線維によるミトコンドリア膜の透過性および損傷の可能性を、ミトコンドリアMDHおよびミトコンドリアROS測定の放出によって調べた。左のグラフに示すように、ミトコンドリアにα-シヌクレインアミロイド線維を添加するとMDHの実質的な放出が観察された。
インスリン線維によってわずかな放出が検出されたが、鶏卵白リゾチームフィブリルは効果がないことが判明した。右グラフは、アミロイド線維がミトコンドリアROS含有量に及ぼす影響を示す。ミトコンドリアROSでは、鶏卵白リゾチームまたはインスリンアミロイド線維の添加時に有意な増強は認められなかったが、α-シヌクレイン線維による治療は、脳ミトコンドリアのROS含有量のかなりの増加につながった。
本ビデオでは、膜レベルでの線維集合細胞毒性のメカニズムに関するモデル研究を紹介し、様々なタンパク質から生じるアミロイド線維が膜損傷と透過性の程度を異なって引き起こす可能性を示す。アミロイド線維とその特異的結合膜のいくつかのトピックは、相互作用し、膜の不安定化とその後の摂動を引き起こす能力を提供するように見えるが、このビデオの後、 ネイティブの形態の相互作用を調査することができます, 原型, 前線維, 異なるペプチドの成熟したアミロイド線維と異なる組織または脳の様々な領域から分離ミトコンドリアと.
