このプレートベースの濁度アッセイの主な利点は、迅速であり、洗練されたセットアップや要件なしに一度にスクリーニングされるいくつかのアミロイド-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤を可能にすることです。フィブリン濁度アッセイにあるヘッド化合物は、走査型電子顕微鏡法で分析したフィブリン血栓中のA-β誘発構造異常を回復させる能力についてさらに評価することができる。スキャン電子顕微鏡分析のための血栓調製の視覚的実証は、製剤の変動が実験結果内の変動に寄与する可能性があるため、極めて重要である。
ここでのデモの焦点は、A-ベータフィブリノーゲン相互作用です。このプロトコルは、他のタンパク質およびフィブリン凝固物との化合物との他の相互作用を分析するために容易に変更することができる。まず、200マイクロリットルの血栓形成バッファーに1.5マイクロモルの血栓形成バッファーを含み、制御ウェルを含み、室温で回転プラットフォーム上でプレートをインキュベートします。
30分後に同時に30マイクロリットルの新しく調製したトロンビン溶液をフィブリノーゲン含有ウェルの中央に直接加えて血栓形成を開始し、350ナノメートルでインビトロ凝固の吸光度を直ちに読み取り、10分間にわたって30〜60秒ごとに測定を繰り返します。フィブリン血栓構造に対するA-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤の効果を評価するために、最初に鉗子を使用して清潔に置き、12ミリメートルのシリコン化ガラスサークルカバーが12ウェルプレートの個々の井戸に滑り込み、各カバースリップに80マイクロリットルのフィブリノーゲンを加え、溶液を均等に広げます。血栓形成を開始するために各ウェルにトロンビン溶液の20マイクロリットルを追加します。
プレートを室温で30〜60分間インキュベーションし、各血栓を2ミリリットルの氷冷ナトリウムカコチル酸緩衝液に2分間静かに浸し、室温で2回、1ミリリットルのピペットを使用して洗浄後に慎重にバッファーを取り除きます。最後の洗浄後、カバースリップの血栓形成の状態を確認し、氷冷2%グルタルアルデヒドを氷上で2〜3ミリリットルに30分間固定します。インキュベーションの終わりに、各ウェルからグルタルアルデヒドを静かに取り出し、氷上で実証したように新鮮なカコチル酸ナトリウム緩衝液で血栓を洗います。
空気暴露から保護された血栓を維持するために、水の間のエタノールを完全に除去することなく氷上で5分間の氷冷エタノールの水を通して固定された血栓を水和する。最後の100%エタノール洗浄中に、カバースリップを臨界点乾燥機のサンプルホルダーに移し、各カバースリップの間に少なくとも1つの洗濯機を入れ、ホルダーをエタノールで満たされた臨界点乾燥機室に入れます。30分の乾燥サイクルの後、カーボンテープを使用してカバースリップを個々の走査型電子顕微鏡スタブに取り付け、サンプルを真空スパッタコーターのスパッタコーティング室に移します。
その後、金パラジウムやその他の導電性材料の20ナノメートル未満のスパッタコートを毎秒4つのオングストロームで25秒間サンプルに塗布し、4キロボルトで2つの二次電子検出器を装備した走査型電子顕微鏡でサンプルを画像化します。フィブリン血栓形成は、溶液を通過する光の散乱を引き起こし、読み取り期間の終わりに高原が増加する濁度をもたらす。フィブリノーゲンがA-β42の存在下でインキュベートされると、溶液の濁度は、フィブリノーゲン単独の約半分の最大高さに達する曲線とともに減少する。
A-β 42インタラクションブロッカーの存在下では、β-アミロイドの効果が改善され、濁度はA-β単独でそれよりも高い。化合物は、A-βが存在しない場合にフィブリン血栓濁度を変化しないので、ブロッカーの効果は背景濁りのために現れません。また、GPRPの存在下での血栓形成は、フィブリン重合を妨害することが知られているペプチドであり、阻害剤の不在下でのフィブリン血栓形成と比較して顕著に減少した濁度を示す。
トロンビンと塩化カルシウムの存在下で生成されたフィブリノーゲンは、細長く、より大きな束と同様に、フィブリンの糸とインターカラットされた糸を有するフィブリンメッシュを形成するだけである。A-βが存在すると、フィブリン糸は凝集体に複数の粘着性のある塊を有して薄くなり、A-β誘発構造異常を示す。濁度アッセイ結果と一致して、A-βフィブリノーゲン相互作用ブロッカーの存在下での血塊形成は、この処置でより少ない塊が観察されるように、A-β誘発性変化からフィブリン凝固塊の構造を部分的に復元する。
血栓濁度アッセイおよび走査型電子顕微鏡分析プロトコルは、いくつかのA-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤を迅速かつ再現可能な方法で評価するために最適化されています。そしてすぐにデータは、インビトロとインビボの両方のさらなる研究に適用することができるフィブリン血栓形成に関する貴重な情報を提供します。
