This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1.細胞播種とトランスフェクション<ol><li>細胞培養フードでは、35mmのガラスボトム共焦点ディッシュのプレート〜300,000〜50万SN56細胞（博士ジェーンRylettの親切な贈り物）とを補充したプリトランスフェクション培地（ダルベッコ改変イーグル培地、DMEM、でカバー10％FBS）。 </li><li>増殖する5％CO 2インキュベーター中で37℃で一晩細胞をインキュベートします。 注：細胞を、トランスフェクション前に約50％〜70％コンフルエントにする必要があります。 </li><li>細胞培養フードでは、蛍光タンパク質は、TGNマーカーをタグ付け発現するプラスミドでトランスフェクト細胞（シアン蛍光タンパク質、のGalT-CFPに接続されたガラクトシルトランスフェラーゼ）、蛍光タンパク質は、でタグ付け（ここでは、リソソーム関連膜タンパク質1、LAMP1、コンパートメントマーカーをタグ付けMRFP）、およびpaGFP（βAPP-paGFPでタグ付けされた目的のタンパク質）。 （これらの構築物は、以前30に記載されています ） </li><li>トランスフェクション試薬およびプラスミドDNAのFで細胞をインキュベートまたは5％のCO 2インキュベーター内で37℃で24時間。ベストバランスの細胞毒性およびトランスフェクション効率にトランスフェクション剤を5μl（例えばリポフェクタミン2000）へのDNA〜2μgの比を使用してください。実際の濃度は異なるプラスミドに合わせて最適化する必要があるかもしれません。ここに記載した実験では、1μgの/共焦点βAPP-paGFPの皿、ランプ1-MRFPの0.3μgの/共焦点皿、および0.2μgの/のGalT-CFPの共焦点皿を使用しています。 注：使用したプラスミドの量は、トランスフェクション効率に依存します。 </li><li>神経細胞株のために：ステップ1.4の後、細胞培養フード内で、予めトランスフェクション培地を除去し、1mMの24時間サイクリックAMP（のdbcAMP）をジブチリル0.1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した2mLのDMEM中SN56細胞に分化します。 </li></ol> 2.顕微鏡ステージ準備<ol><li>プレ暖かいリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、37°C​​にハンクス平衡塩溶液（HBSS）。 imagi前にウォームアップの顕微鏡ステージ37℃にNG。 </li><li>分化培地を除去し、37℃でのHBSS 2mlで置換するために、PBSで細胞を2回洗浄します。顕微鏡ステージの上に置いて細胞を37℃に温めました。 注：細胞をHBSSで約1.5〜2時間のために実行可能です。 </li><li>顕微鏡ステージと平衡する共焦点プレート温度5〜10分を許可します。 </li></ol>ゴルジ体の上にROIの3光活性化<ol><li>顕微鏡の接眼レンズでは、GalTの-CFP、LAMP1-MRFP、およびβAPP-paGFPでトランスフェクトした細胞を見つけます。 <ol><li>高倍率（ すなわち 63Xまたは100X）で油浸レンズを使用してください。蛍光の視覚的な立体構造のため、およびローダミン（MRFP蛍光用）（CFPとGFP蛍光について）FITCを可視化することのできるフィルタセットを使用しています。 </li></ol></li><li> 1μmの各チャネルの共焦点スライスを設定します。低解像度画像を撮ります。 </li><li>興味のあるセルのみ画像をトリミング。 </li><li>調整ノブを使用して、手動で設定セルの中央に焦点面。これは、典型的には、核が最大であるセルの一部です。 </li><li> TGN（GalTの-CFPの蛍光）内（のROI）興味の3-5の円形領域を描画します。 <ol><li> （ すなわちツァイスLSMプログラムで）のROIを描画するには、コマンドコンソールの「編集ROI」ボタンを選択します。 </li><li>円形ROIボタンを選択します。 </li><li>細胞のGalTの-CFP陽性領域の上をクリックしてドラッグします。 注意：多くの顕微鏡用光退色パッケージはこの能力を持っています。 </li></ol></li><li>オーバーレイのROIを用いて細胞の画像を取ります。後で参照するためのROIのコピーを保存します。 <ol><li>画像へのROIを保存するには、「マクロ」ボタンを選択します。 </li><li> 「CopyRoisToOverlay &#39;（C：/AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvbファイルパス）を開始するには、「読み込み」ボタンを押します。 注：475から525ナノメートル（CFP）、バンドパス（BP）を搭載した共焦点顕微鏡、500から530 nmのBP（GFP）、そして、560 nmのロングパス（LP）フィルターセットが必要です。 458 nmおよび488 nmの発光及び540 nmの発光のためのHeNeレーザー、アルゴンレーザーも必要です。 </li></ol></li><li>セットアップ漂白時間経過のための顕微鏡を。 <ol><li>最大電力のレーザダイオード（25 mWの405 nmのレーザーを使用）を設定します。 注意：過度の光活性化は、細胞膜への光毒性または損傷につながる可能性があります。網膜の損傷を避けるために、目の保護を使用します。 </li><li>セットアップイメージングの120サイクルの顕微鏡を。 注：1つの撮像サイクルは、関心領域内で漂白され、セル全体の画像で構成されています。これは、漂白時間コースです。 </li><li>漂白剤（光活性化）すべての画像の後に20〜30回の反復のための唯一のROIに顕微鏡を設定します。イメージが異なります画像や漂白までの時間。各サイクルは、約30秒であるので、画像間の遅延時間を設定します。 注：各サイクルの撮像部は、画像サイズに応じて約15〜30秒を要します。各RO用漂白私は約50ミリ秒です。 20回の反復のためにすべての4 ROIの漂白は、各漂白/画像サイクルの終わりに4秒かかります。 </li></ol></li><li>漂白時間経過を開始します。 </li><li> 15分（イメージングおよび漂白の30サイクル）後に漂白をオフにするが、細胞の画像を撮影し続けます。 注：15分までの時間0は、「パルス」期間です。 </li><li> βAPP-paGFPのクリアランスを追跡するために、45分（漂白なし）用の画像を撮影を続行します。 注意：時間15〜45分は「チェイス」期間です。 </li><li>各チャンネルに表面を作ることによって（ここでLAMP1-MRFP）の工程6に記載の分析方法を使用して、関心のある区画と（ここで、βAPP-paGFP）目的のタンパク質の共局在。 </li></ol> 4.ダウンストリームコンパートメントを決定<ol><li> （これらの実験において）、リソソームが、最終的なコンパートメントあるかどうかを判断するには、タンパク質がリソソーム内に蓄積させるために膜透過性プロテアーゼ阻害剤を追加します。<ol><li> βAPPは、イメージングの前に30分間、0.5μML685、458（特定のγセクレターゼ阻害剤）で一晩または100μMのクロロキン（deacidifiesリソソーム）を使用します。 </li></ol></li><li> 3.8 - ステップ3.1のように細胞と光活性化するを検索します。 </li><li> βAPP-paGFPは、切断の非存在下での蓄積場所を決定するための画像（光活性化なし）さらに45分のためのセル。 </li><li>ステップ6に記載の方法に従ってリソソーム（または他の下流の区画）へのタンパク質の送達およびその後のクリアランスを分析します。 </li></ol> 5.ゴルジ内で光活性化の精度を確保<ol><li> 37°CまでのウォームアップHBSS。 </li><li>すべての共焦点プレートをHBSS中の66μMノコダゾール（処理）またはDMSO（コントロール）の、画像化するために、2ミリリットル溶液を調製します。 <ol><li> 1共焦点板、ピペット2、37℃のHBSS mlの16.60 mMのノコダゾールストックからノコダゾールの7.96μlを添加するために。 </li><li>対照としてそうリューション、ピペット2 2 mlチューブに37℃のHBSS mlのDMSOを7.96μlを添加します。 </li></ol></li><li>イメージングの前に5分間ノコダゾールまたはDMSOをHBSSで細胞をインキュベートします。 </li><li>ステップ3.1のように、細胞を探します。 </li><li>光活性化の前に、光活性化期間後のZスタックを取るために顕微鏡を準備します。 <ol><li> 「Zスタック」ボタンをクリックしてください。高速XYを使用してスキャンを開始します。 </li><li>セルの上部に顕微鏡調整ノブで焦点面を調整します。プレス &#39;マークファースト」は、スタックの最初の位置を設定します。 </li><li>セルの下に顕微鏡調整ノブ（ガラスに最も近い）で焦点面を調整します。プレス &#39;マーク最終」は、スタック内の最後の位置を設定します。 </li><li> Zスタックパネルで、「Z切片」ボタンを押してください。 1μmの「間隔」を設定します。 より高い空間分解能が小さいスタック間隔を積み重ねるために、より多くの画像がする必要があります。注意して​​くださいスタック用の撮像期間を長くとること。 </li></ol></li><li>ステップ3.7から3.8で説明したように、細胞をブリーチ。 0分〜15分（30フレーム）のフォト活性化し、画像。 </li><li> 30フレーム後に撮影を停止します。すぐにビデオの画像を保存します。 注意：これは第2の撮像シーケンスを開始する前に、保存されていない場合、一部の顕微鏡は、最初のビデオを上書きする可能性があります。 </li><li>ビデオを保存した後、すぐにステップ5.5からのパラメータを使用して、Zスタックを取得します。 </li><li>ステップ6で説明したように、GalTの-CFP（または他のゴルジマーカー）とβAPP-paGFPを共局在。 注意：CFPは急速に光退色し、撮像期間の終了までに表示されない場合があります。共局在は、GalTの-CFPとできない場合があります。共局在化が必要な場合は、GalTのにタグをMRFPを使用しています。 </li></ol> 6.小胞と共局在フィルタリング<ol><li>コンパートメントの表面 （例えばLAMP1-MRFP）とタンパク質のOを行うために解析プログラム（例えばIMARIS）を使用しますF関心（ 例えば βAPP-paGFP）。 </li><li>上部メニューバーの突破のボタンをクリックすることで、解析プログラムの「サーパス」のセクションを入力します。 </li><li>一番左のパネル（左から5 番目のボタン ）の上部の表面ウィザード]ボタンを選択します。 </li><li>小胞（ すなわち βAPP-paGFP蛍光、目的のタンパク質）をフィルタリングするチャンネルを選択します。 </li><li>次のウィザードとプレスの分野で最大の小胞の直径を提出することによって、バックグラウンド減算を実行します。解析プログラムが自動的に選択 - 関心のあるチャネル内の領域 - フィールドで最大の小胞に由来した閾値に基づいて。 <ol><li>手動で必要に応じて選択項目を絞り込んで、しきい値の背景を調整します。 </li></ol></li><li>しきい値の選択画面の下部には、組み合わせた表面を分離する「スプリット感動オブジェクトのオプションをチェックします。 注意：多くの小胞が密接にグループ化されている場合GETHER、一面の下でこれらのオブジェクト解析プログラム意志グループ。 <ol><li> 10-15代表小胞を選択し、平均ベシクル径を計算し、ウィザードに結果を入力してください。 </li></ol></li><li> 「品質」（各スポットの途中でチャネルの強度）にしきい値を増加または減少させることによって選択されたシードポイントを絞り込み。 注意：関心のあるチャネルの表面が作成されます。選択された表面の更なる改良は、この時点で行うことができます。各小胞の画素数に基づいて、しきい値の小胞。 </li><li>この表面と元のチャネルをマスクします。マスクするには、表面の作成ウィザード（鉛筆）で、左から4番目のタブを選択します。 </li><li> 「すべてのマスク」を選択します。興味のある小胞との新しいチャネルが作成されます。 注意：マスク処理中に、元のチャンネルを複製するためのオプションが提供されます。元のデータを保存する必要がある場合は、このオプションを選択します。 </li><li>繰り返しのフィルタリングされていないチャネル（ すなわち LAMP1 MRFP、コンパートメント）6.7を介して、TEPS 6.1。 </li><li>トップツールバーでは、共局在ツールを選択します。 <ol><li>トップパネルには、共局在するチャネルのヒストグラムが表示されるように、最近作成したマスクされたチャンネルを選択します。 </li><li>利用可能なデータをすべて選択します。分析後に時々存在する暗いピクセルがあります。ヒストグラムのこれらのピクセルを選択しないでください、彼らは結果を歪曲します。 </li><li>右端のパネルで、「Colocチャンネルを構築」を選択します。これは、共局在のピクセルを含む新しいチャネルを作成します。データは、「チャンネル統計」ボタンの下の同じパネルになります。データは.CSVファイルとしてエクスポートすることができます。 </li><li> 「材料の割合は、共局在「統計を使用してください。このオプションは、アカウントにオブジェクトのピクセルと大きさの強度をとります。 </li></ol></li></ol>

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A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

著者は全く競合する金融利害や利害の衝突を持っていません。

この技術は、その後の人身売買と切断を可視化するために、TGNにpaGFPでタグ付けされた膜タンパク質の正確な光活性化について説明します。 paGFPは25十年以上前に作成されたが、これは下流のコンパートメントに新生タンパク質の輸送を追跡する正確な光活性化の最初の例です。 APP-paGFPを使用した以前の研究では、光活性化ゴルジ体11であると考えられた細胞の核周囲の領域?...

アルツハイマー病（AD）の特徴は、脳における老人斑および神経原線維変化（NFT）の存在です。老人斑の主要構成成分はβアミロイド（Aβ）です。 Aβは、その前駆体から誘導されます。アミロイド前駆体タンパク質（APP）1。 APPのアミロイド形成性切断がβセクレターゼ2によるAPPの細胞外ドメインの除去から始まります。残りの99残基のカルボキシル末端フラグメント（CTF）は、Aβ3-7を生成するために γセクレターゼによって切断され得ます。多くの実験は、細胞表面からエンドソーム/リソソーム系に内在化した後、細胞表面APPの切断を記録しているが、最近の多くの研究は、APPの細胞内輸送は、その処理8-11の調節においても重要であることを示唆しています。 γセクレターゼ阻害剤とのAβIMMUNとAβのレベルを調節で多くの試みがなされていますotherapies。しかしながら、これらの治療法との最近の臨床試験は全く効果を示さなかった、そして、いくつかのケースでは、12害を引き起こしました 。 Aβ産生を調節する未開発の戦略は、APPの細胞内局在およびγセクレターゼの相互作用を変化させることです。ゴルジ、形質膜、およびエンドソーム/リソソームは、すべてのAPPのγ切断の可能なロケールとして提案されています。我々の研究室からの研究は、APPおよびγセクレターゼは、リソソーム膜13の常駐タンパク質であることを示唆しています。さらに、我々は、リソソームγセクレターゼは、酸性至適pH 13を有していることを見出しました。さらに、クロロキンまたはNH 4 Clでエンドソーム/リソソーム系のアルカリ、Aβ14の産生を減少させることが示されています。 γセクレターゼ阻害またはノックアウトまたはプレセニリンは、リソソーム15-17におけるAPP-CTFSの蓄積につながります。また、APPのエンドサイトーシスを中断すると、Aβ産生18-20を低下させます。 エンドソーム/リソソーム系からリサイクル新生タンパク質およびタンパク質のための仕分け局としてゴルジ体の重要性にもかかわらず、APPの細胞内輸送を詳細21で検討されていません。最近の研究は、APPはレトロマー複合体との相互作用を介してトランスゴルジネットワーク（TGN）に再循環させることができることを示しています。レトロマー複合体のダウンレギュレーションは、Aβ産生8,22-24を減少させます。しかし、ゴルジ体からのAPPの出力は十分に研究されていません。 そのようなトランスフェリン受容体などの細胞表面タンパク質のエンドサイトーシスに追従して、容易に標識され、続いており、細胞内タンパク質の輸送以下がより困難です。実際には、いくつかのタンパク質は、それらの細胞内輸送が撮像ありました。このような光活性化-GFP（paGFP）などの蛍光タンパク質タグの出現は、細胞内輸送を調べるために新しいツールを提供してきました。光活性化-GFPは、GFの一形態であります合成後、ほとんど目に見えないですが、413 nmのレーザー光によって活性化された後、強い緑色（GFP）の蛍光を開発し、この信号は日25,26のために安定している、P。 paGFPを用いた構築物は、リソソームタンパク質のリソソーム内輸送を実証するために使用されている膜タンパク質1（LAMP1）25、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSVG、分泌経路のマーカー）27の細胞表面の配信、及びペルオキシソームの代謝回転28とオートファゴソーム29。 生細胞にTGNからのAPPのソートを可視化するために、我々は、C末端（βAPP-paGFPという）30上の光活性化（paGFP）に結合されたAPPの最後の112アミノ酸を発現するプラスミドを設計しました。我々はまた、完全長のAPPでこれらの実験を行い、同様の結果を達成しています。それは明るい画像を提供するため、βAPP構築物は、ここで使用されています。我々その後、フォトアクティブ＆＃946;のみTGNにおけるAPP-paGFP、TGNマーカーガラクトシルトランスフェラーゼ（GalTの）によって区画として。 APPは核周辺領域からAPPおよびクリアランスの迅速な軸索 ​​輸送を視覚化するためにpaGFPでタグ付けされているが、これは別の11,31,32に1慎重に定義された区画からのAPP人身売買の最初の実証です。ここでは、正確なTGN内の光活性化と下流の区画およびリソソーム30からの後続の切断や隙間にAPPの出力を示しています。ゴルジ内で正確な光活性化は、他のタンパク質系に広く適用可能です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

β-アミロイド（Aβ）は、アルツハイマー病患者の脳に見られる老人斑の主要構成成分です。 Aβは、βおよびγセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（APP）の連続的切断に由来します。 AD病理へのAβの重要性にもかかわらず、これらの切断の細胞内局在は、十分に確立されていません。我々の研究室での作業などが細胞表面から内部移行した後のAPP処理にエンドソーム/リソソーム系を巻き込みます。しかし、APPの細胞内輸送は比較的understudiedです。 細胞表面タンパク質は、多くの標識技術に修正可能であるが、ゴルジ体からの膜タンパク質の輸送を以下のための単純な方法は存在しません。この目的のために、我々はC末端に光活性化GFP（paGFP）でタグ付けされたAPPコンストラクトを作成しました。合成後、paGFPは低い基底蛍光を有するが、413 nmの光Tで刺激することができO強く、安定した緑色の蛍光を生じます。ターゲットとしてシアン蛍光タンパク質（GalTの-CFP）に結合されたゴルジマーカーガラクトシルトランスフェラーゼを使用することにより、我々はトランスゴルジネットワーク内の正確光活性化するAPPすることができます。それは蛍光で識別下流区画にトラフィック早期エンドソーム（Rab5の）、後期エンドソーム（Rab9）およびリソソーム（LAMP1）のためのコンパートメントマーカータンパク質をタグ付けとして光活性化APP-paGFPは、その後に続くことができます。さらに、クロロキンまたはγセクレターゼ阻害剤L685、458を含むAPP処理に阻害剤を使用して、我々は、単一の細胞内でAPPのプロセシングを調べるために、パルスチェイス実験を実行することができます。 我々は、APPの大部分は、細胞表面に現れることなく、リソソームに迅速に移動し、その後セクレターゼ様の切断によってリソソームから除去されることがわかります。この技術はあちこち細胞内タンパク質の輸送と処理を以下のためpaGFPの有用性を実証下流の区画にゴルジ体をメートル。

典型的な結果は、βAPPはTGNを残し、ランプ1（ 図1aおよび b）に急速にトラフィックに表示されます表示されます。光活性化期間の間、小胞は、リソソーム（ 図1b）宛ゴルジを逸脱分かります。 TGNで光活性化がある間阻害剤処理なしで、paGFP蛍光はリソソームに表示されます。光活性化を停止した後、βAPP-paGFPは急速に（1bに図1aを比較）リソソームからク?...

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Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

細胞表面タンパク質の輸送を比較的容易に研究されているが、細胞内タンパク質の輸送を可視化することははるかに困難です。ここでは、光活性化GFPを組み込んだコンストラクトを使用して、正確にダウンストリームの区画にゴルジ体からのアミロイド前駆体タンパク質に従い、その隙間に従うようにする方法を実証します。

光活性化GFPでAPPの細胞内輸送をイメージング

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

imaging-the-intracellular-trafficking-of-app-with-photoactivatable-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K ビュー.  Western University. 細胞表面タンパク質の輸送を比較的容易に研究されているが、細胞内タンパク質の輸送を可視化することははるかに困難です。ここでは、光活性化GFPを組み込んだコンストラクトを使用して、正確にダウンストリームの区画にゴルジ体からのアミロイド前駆体タンパク質に従い、その隙間に従うようにする方法を実証します。 

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Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

生物学

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

FDG micro-PET/CTマウスにおける褐色脂肪の機能イメージング

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

モザイク大人のライブイメージングのためのトマト/ GFP-FLP / FRT方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;視細胞

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.