Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine

Die Herstellung von liposomalen Nanokapseln durch eine Extrusionstechnik wird Schritt für Schritt in der Einschlussung von Tarin 48 Kilodaltons kugelig in hydrophilem Protein aus Kolokasien esculenta gereinigt durchgeführt werden. Alle Verfahren zur Charakterisierung der Nanokapseln umfassen die Rasterelektronenmikroskopie und die dynamische Lichtstreuung wird ebenfalls befolgt. Kapulationsverfahren können einige Herausforderungen von der Lipidwahl bis zur Erreichung einer hocheffizienten Verkapselung, die die Bio-Aktivität der eingeschlossenen Moleküle zu halten.

Das protokollarisch, das beschrieben wird, kann einige dieser Schwierigkeiten überwinden. Wiegen Sie die Liposomenkomponenten mit einem analytischen Gleichgewicht. Lösen Sie die Lipidkomponenten in Chloroform mit einem volumetrischen Kolben auf, der in einen Rotationsverdampfer passt, um Materialverlust zu vermeiden.

Die Mischung bei 150 Umdrehungen 15 Minuten rühren. Entfernen Sie das Chloroform mit einem Rotationsverdampfer. Stellen Sie den volumetrischen Kolbenmund auf die Standardposition für beste Effizienz ein, während Sie mit dem Wasser aus dem Heizbad in Kontakt stehen.

Legen Sie die Parameter gemäß dem beschriebenen Protokoll fest. Nach ca. 25 Minuten den Kolben entfernen und das verdampfte Lösungsmittel entsprechend entsorgen. Ein dünner und undurchsichtiger Film wird gebildet und kann leicht visualisiert werden.

Hydratisieren Sie den Lipidfilm in einer Ammoniumsulfatlösung, die Tarin mit einem Milligramm pro Milliliter enthält. Die Mischung 40 Minuten rühren und über Nacht bei vier Grad Celsius bebrüten. Dann beschallen Sie die Suspension für eine Minute bei 25 Grad Celsius, Raumtemperatur.

Um die Vesikelgröße zu reduzieren und eine Aggregation zu vermeiden, legen Sie die Polycarbonatmembran zwischen zwei vornassen Filterstützen und legen Sie sie in den Halter. Legen Sie eine leere Spritze in das Gerät ein, füllen Sie die andere mit einem Milliliter der liposomalen Suspension und legen Sie sie auf der gegenüberliegenden Seite ein. Führen Sie eine 12-Zyklus-Extrusion durch eine 2 Mikrometer Polykarbonat-Porenmembran durch.

Drücken Sie die Probe langsam von einer Spritze auf eine andere. Am Ende sollte die liposomale Suspension während des Exkursionsprozesses durch Größenreduktion deutlich werden. Etwa 2 Milliliter der Probe können in diesem Schritt verloren gehen.

Trennen Sie die Liposomen durch Ultrazentrifugation. Wiegen Sie zunächst die Probe in das Titanrohr und balancieren Sie die Rohre. Überprüfen Sie das zu befüllende Mindestvolumen, und passen Sie ggf. das Volumen mit Ammoniumsulfat an.

Die Titanrohre in den Schwenkeimer einbauen. Öffnen Sie die Zentrifugentür und platzieren Sie den Rotor darin. Schließen Sie die Zentrifugentür, drücken Sie Vakuum und warten Sie, bis das Vakuum zwischen 200 und weniger als 20 Mikrometern erreicht.

Passen Sie die Parameter in der Ultrazentrifugenanzeige an. Drücken Sie den Rückruf, überprüfen Sie die Bedingungen, und starten Sie den Lauf. Lassen Sie nach 90 Minuten das Vakuum los, indem Sie auf den Vakuumknopf klicken und die Zentrifugentür öffnen.

Entfernen Sie den Rotor von innen. Halten Sie die Ultrazentrifugenprobe auf Eis und trennen Sie dann den Überstand vom Pellet, indem Sie das Rohr auf den Kopf stellen, in eine Einwegzentrifuge von 59 mil, um den Überstand vom Pellet zu trennen. Bewahren Sie den Überstand, der das ungekapselte Protein enthält, bei vier Grad Celsius auf.

Dies wird verwendet, um die Verkapselungseffizienz zu bestimmen. Das Pellet wird als durchscheinendes Gelee präsentiert. Das Pellet aufhängen und HEPES gepufferte Saline-Lösung erhitzen.

Weitere Informationen finden Sie im Protokoll. Bestimmen Sie die Verkapselungseffizienz durch das Petersons Protokoll, um Lipidstörungen in der Proteinquantifizierung zu vermeiden. Die Proben sollten in dreifacher Ausfertigung analysiert werden.

In einem Mikrofugenrohr den lipsomalen Überstand oder BSA mit einem Milligramm pro Milliliter mit Wasser auf ein Endvolumen von einem Milliliter verdünnen. DOC hinzufügen und 10 Minuten inkubieren. 1 Milliliter 72%TCA hinzufügen und gut mischen.

Zentrifuge bei 3.000 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie das Rohr nach unten abwenden, es auf ein saugfähiges Papier legen und trocknen lassen. Das Pellet in einem Milliliter Wasser aufhängen.

Mischen Sie gründlich, um sicherzustellen, dass das Pellet gelöst ist. Übertragen Sie dann die Probe in reageröhrte. Einen Milliliter Reagenz A hinzufügen, 10 Minuten bei Raumtemperatur mischen und inkubieren.

5 Milliliter Reagenz B hinzufügen, 30 Minuten bei Raumtemperatur mischen und inkubieren, vor Licht geschützt. Bestimmen Sie die Absorption bei 750 Nanometern und berechnen Sie die Verkapselungseffizienz. Der Größendurchschnitt und die Größenverteilung werden durch dynamische Lichtstreuung bestimmt.

Übertragen Sie die liposomalen Nanovesiken auf eine Einweg-Größenküvette. Passen Sie die Küvette in das Gerät ein. Stellen Sie die Geräteparameter ein.

Zur Stabilitätsbestimmung die Liposomen bei vier Grad Celsius lagern und die Größenverteilung und den Größendurchschnitt regelmäßig überprüfen. Die Liposomencharakterisierung durch Rasterelektronenmikroskop wird nach Murta und Ramasamy in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Befestigen Sie die Glasabdeckung sausen in der Unterseite einer Petrischale mit einem Klebeband.

Beschichten Sie die Deckelschlüpfer mit Poly-L-Lysin. Legen Sie ein nasses Filterpapier in die Petrischale, um Feuchtigkeit zu erhalten und eine Stunde lang zu brüten. Mit destilliertem Wasser abspülen.

Fügen Sie einen Tropfen der Probe hinzu und lassen Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur trocknen. Um die Proben zu fixieren, bedecken Sie sie mit Glutaraldehyd, das im Phosphatpuffer hergestellt wird. Legen Sie nasse Filterpapiere in die Petrischale.

Es ist wichtig, die Petrischale zu versiegeln. 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Spülen Sie die Abdeckung rutscht dreimal für jeweils fünf Minuten, mit dem gleichen Phosphatpuffer.

Dehydrieren Sie die Proben wie folgt, indem Sie in einer zunehmenden Ethanolkonzentrationslösung von 35% auf absolutes Ethanol waschen. Die Proben mit Hexamethyldisilazan 10 Minuten chemisch trocknen. Das Hexamethyldisilazan sollte sorgfältig in einer Dunstabzugshaube manipuliert werden.

Proben sollten über Nacht in einem Trockenschrank oder in der Dunstabzugshaube bei Raumtemperatur trocknen dürfen. Montieren Sie die getrockneten Proben auf einem Stub, mit einem kohlenstoffleitfähigen Klebeband. Sputter die Stubs mit Gold.

Nehmen Sie SEM-Bilder mit einem Rasterelektronenmikroskop, SEM, bei niedrigem Vakuummodus und Niederspannung, 20 Kilovolt auf. Abbildung eins beschreibt die Nano-Liposomen-Präparation. Phospholipide, Dope, Peg und Chems, die wichtigsten Liposomenbestandteile, wurden zuerst in Chloroform gelöst, um den Lipidfilm zu erhalten.

Der Lipidfilm wurde dann in einem Kochsalzlösungspuffer rehydriert, der das hydrophile Protein Tarin enthält, das eingeschlossen werden soll, und die Inkubation sollte über Nacht vorgeformt werden. Dann werden Beschallung und Extrusion angewendet, um kleine unilamellare Vesikel zu erzeugen. Der Ultrazentrifugationsschritt trennt die liposomale Zubereitung von freien Lipiden und unverkapseltem Protein.

Während der Überstand für die Bestimmung der Einschlusseffizienz verwendet wird. Nanoliposomen, die nach der oben genannten Methode hergestellt werden, weisen eine Größenverteilung von 51 bis 396 Nanometern und eine durchschnittliche Größe von 155 Nanometern auf. Die Zubereitung ist homogen, da der Polidispersitätsindex 168 beträgt.

Eine hohe Einschlusseffizienz von 83% wird erreicht, wenn die Liposomen durch eine 2 Mikrometer porengroße Membran extrudiert werden. Morphologische Nanolipominitika wurden durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Liposomen sollten schließlich ähnlich wie lebende Zellen behandelt werden, um qualitativ bessere Bilder zu erhalten.

Befestigungs- und Trocknungsverfahren sind wichtig, um die Visualisierung kleinerer intakter Vesikel zu gewährleisten, die über 20 Kilovolt unter Vakuumbedingungen unterstützen. Die Abbildungen 2A und 2B zeigen runde liposomale Vesikel im Bereich von 121 Nanometern, analysiert bei 20 Kilovolt. Während die Abbildungen 2C und 2D unzureichend vorbereitete Proben anzeigen.

Misshandelte Proben sind nur zur Beobachtung größerer oder oder beschädigter Vesikel zulässig, die Vakuum- und Spannungs- oder Spannungsbedingungen nicht widerstehen können. Das hier beschriebene Protokoll ermöglichte die Herstellung von reproduzierbaren Vesikeln mit einer runden Form, einer kleinen Oberfläche und einer durchschnittlichen Größe von etwa 150 Nanometern. Die Methode kann verwendet werden, um komplexe und große Moleküle einzufangen, als tetramerisches Protein, das einen hydrophilen Korrektor aufweist.

Die Mangelhafte Selbsteinschließung ist höher als 80% und die Leckrate ist sehr niedrig, unter 1,5%Wenn die Nanokapseln bei vier Grad Celsius gelagert werden. Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen bei der Verkapselung großer Moleküle wie teri helfen würde.