압출 기술에 의한 리포소말 나노캡슐의 제조는 콜로카아 에스컬렌타로부터 정제된 수성단백질에서 타린 48킬로달톤의 구형의 함정에 단계별로 수행될 것이다. 나노 캡슐의 특성화를위한 모든 절차는 스캐닝 전자 현미경 을 포함하고 동적 빛 산란도 따를 것이다. 캡슐화 절차는 지질 선택에서 고효율 캡슐화의 성취에 이르기까지 몇 가지 도전에 직면 할 수 있으며, 갇힌 분자의 생체 활성을 유지할 수 있습니다.
설명될 프로토콜은 이러한 어려움 중 일부를 극복할 수 있습니다. 분석 균형을 사용하여 리포솜 성분의 무게를 측정합니다. 재료의 손실을 방지하기 위해 회전 증발기에 맞는 체적 플라스크를 사용하여 클로로포름에 지질 성분을 녹입니다.
150 RPM에서 15분간 저어줍니다. 회전 증발기로 클로로폼을 제거합니다. 체적 플라스크 입을 표준 위치로 조정하여 최상의 효율을 높이고 가열 목욕의 물과 접촉합니다.
설명된 프로토콜에 따라 매개 변수를 설정합니다. 약 25분 후에 플라스크를 제거하고 증발된 용매를 적절히 폐기합니다. 얇고 불투명한 필름이 형성되어 쉽게 시각화할 수 있습니다.
밀리리터당 1밀리그램의 타린을 함유한 암모늄 황산염 용액으로 지질 필름을 수분화합니다. 혼합물을 40분간 저어주고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 실온 25도에서 1 분 동안 서스펜션을 초음파 처리합니다.
소포 크기를 줄이고 응집을 피하기 위해 폴리카보네이트 멤브레인을 두 개의 사전 습식 필터 지지대 사이에 배치하여 홀더에 넣습니다. 빈 주사기 하나를 장치에 삽입하고, 다른 한 쪽을 리포소말 서스펜션의 1밀리리터로 채우고, 반대쪽에 삽입합니다. 2 마이크로미터 폴리카보네이트 모공 막을 통해 12사이클 압출을 수행한다.
샘플을 하나의 주사기에서 다른 주사기로 천천히 밀어 넣습니다. 결국, 리포소말 서스펜션은 크기 감소의 결과로, 소풍 과정에서 명확해져야 한다. 이 단계에서 는 시료의 약 2 밀리리터를 잃을 수 있습니다.
리포솜을 초원심분리에 의해 분리합니다. 첫째, 티타늄 튜브에 샘플을 무게와 튜브의 균형을. 채워질 최소 부피를 확인하고 필요한 경우 황산암모늄으로 부피를 조정하십시오.
티타늄 튜브를 스윙 버킷에 넣습니다. 원심분리기 문을 열고 로터를 내부에 놓습니다. 원심분리기 문을 닫고 진공을 누르고 진공이 200미크론 미만이 될 때까지 기다립니다.
초원심분리기 디스플레이의 매개변수를 조정합니다. 리콜을 누르고 조건을 확인하고 실행을 시작합니다. 90분 후 진공 버튼을 클릭하여 진공 을 해제하고 원심 분리기 문을 엽니다.
내부에서 로터를 제거합니다. 얼음에 초원심분리기 샘플을 유지한 다음, 튜브를 거꾸로 뒤집어 서퍼네티를 펠릿에서 상환을 분리하는 일회용 59 mil 원심분리기로 분리합니다. 캡슐화되지 않은 단백질을 함유한 상체를 섭씨 4도에 보관하십시오.
이는 캡슐화 효율을 결정하는 데 사용됩니다. 펠릿은 반투명 젤리로 제시됩니다. 펠릿을 일시 중단하고 HEPES 완충식식용액을 가열합니다.
자세한 내용은 프로토콜을 확인하십시오. 단백질 정량화의 지질 간섭을 피하기 위해 피터슨의 프로토콜에 의해 캡슐화 효율을 결정합니다. 샘플은 삼중에서 분석해야 합니다.
마이크로퍼지 튜브에서, 1 밀리리터의 최종 부피에 물로 밀리리터 당 1 밀리그램에 입술 상피 또는 BSA를 희석. DOC를 추가하고 10분 동안 인큐베이션을 합니다. 72%TCA의 밀리리터 1밀리리터를 넣고 잘 섞으세요.
실온에서 15 분 동안 3, 000g의 원심 분리기. 튜브를 아래쪽으로 피하고 흡수성 용지에 놓고 건조시켜 주체를 조심스럽게 폐기하십시오. 펠릿을 1밀리리터의 물로 중단합니다.
펠릿이 용해되었는지 확인하기 위해 철저히 섞습니다. 그런 다음 샘플을 테스트 튜브로 전송합니다. 시약 A1 밀리리터를 넣고 실온에서 10분 동안 혼합하고 인큐베이션합니다.
시약 B5 밀리리터를 추가하고, 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 혼합하고 인큐베이션합니다. 750 나노미터에서 흡광도를 결정하고 캡슐화 효율을 계산합니다. 크기 평균 및 크기 분포는 동적 광 산란에 의해 결정됩니다.
리포소말 나노베스캔을 일회용 크기 조정 큐벳으로 옮기다. 장비 내부에 큐벳을 장착합니다. 장비 매개 변수를 설정합니다.
안정성 측정을 위해 리포솜을 섭씨 4도에 보관하고 크기 분포와 크기 평균을 정기적으로 확인합니다. 전자 현미경을 스캔하여 리포솜 특성화는 삼중에서 무르타와 라마사미에 따라 수행됩니다. 페트리 접시 바닥에 유리 커버 슬립을 테이프로 고정합니다.
폴리 L-리신으로 커버 슬립을 코팅합니다. 페트리 접시 안에 젖은 필터 용지를 놓고 수분을 유지하고 1시간 동안 배양합니다. 증류수로 헹구는 다.
시료 한 방울을 넣고 실온에서 1시간 동안 건조시키십시오. 샘플을 수정하려면 인산염 버퍼로 준비된 글루타랄데히드로 덮습니다. 페트리 접시 안에 젖은 필터 용지를 넣습니다.
페트리 요리를 밀봉하는 것이 중요합니다. 48시간 동안 섭씨 4도에서 배양하세요. 커버를 각각 5분 동안 세 번 헹구고 동일한 인산염 버퍼를 장착합니다.
35%에서 절대 에탄올까지 증가하는 에탄올 농도 용액에서 세척하여 다음과 같이 샘플을 탈수합니다. 화학적으로 10 분 동안 hexamethyldisilazane로 샘플을 건조. hexamethyldisilazane은 연기 후드 내부에 신중하게 조작해야합니다.
샘플은 실온에서 건조기 내부 또는 연기 후드 내부에서 밤새 건조 할 수 있어야합니다. 말린 샘플을 스텁에 탄소 전도성 접착제 테이프로 장착합니다. 골드와 스텁을 스퍼터.
낮은 진공 모드와 저전압, 20킬로볼트에서 스캔 전자 현미경, SEM으로 SEM 이미지를 기록합니다. 그림 하나는 나노 리포솜 제제를 설명합니다. 주요 지질 성분인 인지질, 도프, 페그 및 화학 성분은 지질 필름을 얻기 위해 클로로포름에 먼저 용해되었다.
지질 필름은 식염수 단백질, 타린을 포함하는 식염수 버퍼로 재수화되어 함정에 빠뜨리고, 잠복기는 하룻밤 사이에 미리 형성되어야 한다. 이어서, 초음파 처리 및 압출이 적용되어 작은 단색 소포를 생성한다. 초원심분리 단계는 지질 제제를 무료 지질과 캡슐화되지 않은 단백질과 분리합니다.
상체는 함정 효율의 결정에 사용됩니다. 앞서 언급한 방법론을 사용하여 생산된 나노리포솜은 51~396나노미터, 평균 크기 155나노미터에 이르는 크기 분포를 나타낸다. 정치지수가 168이기 때문에 준비는 균일하다.
리포솜이 2 마이크로미터 모공 크기의 멤브레인을 통해 압출될 경우 83%의 높은 함정 효율에 도달합니다. 형태학적 나노리포솜 특성은 전자 현미경 검사를 스캔하여 평가하였다. 리포솜은 더 나은 품질의 이미지를 얻기 위해, 살아 있는 세포와 유사하게 마침내 취급되어야 합니다.
진공 조건에서 20킬로볼트 이상을 지원하는 소형 온전한 소포의 시각화를 보장하기 위해 고정 및 건조 절차가 중요합니다. 그림 2A 및 2B 디스플레이 둥근 모양의 리포소말 소포는 121 나노미터 범위에서, 20 킬로볼트로 분석. 그림 2C 및 2D는 부적절하게 준비된 샘플을 표시합니다.
학대 된 샘플은 진공 및 전압 조건에 저항 할 수없는 더 크고 손상된 소포의 관찰을 위해만 허용되었습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 둥근 형상, 작은 표면 및 약 150나노미터의 평균 크기를 표시하는 재현 가능한 소포의 생산을 허용한다. 이 방법은 복합체및 큰 분자를 포획하는 데 사용할 수 있으며, 테트라메릭 단백질로서, 친수성 교정기를 나타낸다.
결핍된 자기 함정은 80% 이상이며 누출률은 매우 낮고, 나노캡슐이 섭씨 4도에 저장될 때 1.5%로 열등하다. 우리는이 비디오가 테리와 같은 큰 분자의 캡슐화에 도움이 되기를 바랍니다.
