ここでは、免疫蛍光、新しい方法、およびDNAドットブロットを用いて、細胞および脳組織における5-ヒドロキシメチルシトシンを検出するプロトコルを提示する。5-ヒドロキシメチルシトシン、すなわち5hmCは、エピジェネティック修飾を軽減し、遺伝子発現を調節する上で重要な機能を果たし、複数の神経疾患に関与する。
実際、我々の方法は、複数の細胞および組織の5hmCを検出するために使用することができる。これは便利で、ラボで一般的な機器で実行することができます。まず、プラスチック製のボード上にマウスの顔を上に置き、各手足を粘着テープで固定します。
手術用はさみを使って皮膚や筋肉を切り抜き、胸腔を開きます。心臓を露出させ、細かい外科用はさみで右心房の小さな部分を切り落とす。10ミリリットルの使い捨て、殺菌されたシリンジを使用して、冷たいPBSで左心室からマウスを浸透する。
次に、マウスに 4%PFA を付けて、硬くなるまで浸透させます。その後、骨の鉗子で頭蓋骨を開き、脳を取り除きます。4%PFAの5ミリリットルで満たされた15ミリリットルの遠心管に脳を入れ、摂氏4度で保存します。
24時間後、脳を30%スクロース溶液に移し、完全な脱水のために摂氏4度にしておきます。切断する前に、脳を最適な切断温度化合物に浸透させ、少なくとも1時間はマイナス20度まで冷却した。クライオスタットミクロトームを使用して、20〜40マイクロメートルの厚さで脳サンプルを切り離します。
PBSにセクションを収集し、摂氏4度で保存します。興味のある脳のセクションをピックアップし、PBSと24ウェルプレートにそれらを入れます.シェーカーでPBSで10分間洗浄します。
PBSを取り出し、37°Cで予熱した1モル塩酸を30分間処理します。塩酸は腐食性であり、化学ホールドで準備してください。その後、サンプルをPBSで5分間3回洗浄し、3%正常なヤギ血清と0.1%トリトンX-100を含むPBSでそれらをブロックします。
サンプルは、室温でシェーカーに1時間放置します。特定の一次抗体をセクションに加え、シェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、サンプルを取り出し、室温で1時間放置します。
PBSでサンプルを3回洗浄し、二次抗体を添加します。プレートにアルミニウムを覆い、揺れながら室温で1時間放置します。インキュベーション後、サンプルをPBSで3回洗浄し、スライドに取り付けます。
アンチフェードマウント媒体を100~150マイクロリットル加え、プレミアムカバーガラスで覆い、マニキュアでシールします。通常の顕微鏡または共焦点顕微鏡で脳の切片を画像化します。ゲノムDNAを分離するには、海馬、皮質、小脳組織を氷冷皿で解剖することから始めます。
1ミリリットルのDNAライシスバッファーを加え、組織を粉砕します。サンプルをきれいなマイクロ遠心分離チューブに移し、600マイクロリットルのリシスバッファーごとに250マイクログラムのプロテイナーゼKを加えます。その後、サンプルあたり約50マイクログラムのRNase Aを加え、摂氏37度で少なくとも12時間インキュベートします。
インキュベーション後、等量のフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを加え、十分に混ぜます。原稿の方向に従って混合物を遠心分離し、上清を新しい管に移します。上清に600マイクロリットルのクロロホルムを加え、原稿の指示に従って十分に混ぜ合わせ、遠心分離機を加えます。
上清を新しいチューブに移し、500マイクロリットルのイソプロパノールを加えます。DNAを沈殿させるために、完全に混合し、再び遠心分離機を再び混合します。遠心分離後、上清を捨て、原稿の指示に従って70%エタノールでDNAペレットを洗浄する。
空気はDNAペレットを完全に乾燥し、次にTris-HClバッファーに溶解する。開始する前に、原稿の指示に従って必要な溶液とサンプル混合物を準備してください。DNAサンプルを摂氏100度に10分間加熱して変性し、氷の上に置きます。
ナイロン膜の適切なサイズをカットし、6X SSCでそれをすすいでください。膜をドットブロット装置に設置し、真空ポンプを接続します。6マイクロリットルのドットを膜に見つけ、摂氏80度で30分間ハイブリダイズします。
その後、無脂肪ミルクとトリス緩衝生理食物(TBS)でサンプル膜を1時間ブロックします。ポリクローナルウサギ抗5-ヒドロキシメチルシトシン抗体を膜に加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、試料膜を室温に1時間放置し、その後、膜をTBSで3回洗浄します。
膜を抗ウサギ二次抗体で30分間インキュベートし、TBSで3回洗浄します。このプロトコルは、成体マウスの海馬における5-ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)を可視化するために使用することができる。
神経細胞に対する抗体を用いた免疫蛍光は、5hmCはニューロンに5hmCの濃縮があることを明らかにする。ニューロンの発達中の5hmCのダイナミクスは、増殖および分化された成体神経幹細胞から分離されたDNAサンプルのドットブロットアッセイで決定することができる。5hmCのグローバルレベルは分化中に有意に増加し、ニューロンの5hmCのレベルは神経幹細胞よりも高い。
この方法の重要なステップは、DNAサンプルの完全な変性を確認することです。
