これは、疾病耐性、ミネラル含有量など、技術的に困難または決定される高価な形質を繁殖させるために非常に有用であろう。これは非常にシンプルでコスト効率が高く、高スループットの手法です。まず、96 ウェル PCR プレートの各ウェルに 4 枚のリーフ ディスクを配置します。
各井戸に50ミリリットルのバッファーA溶液を加えます。マイナス80度の冷凍庫でプレートを10分間冷凍します。その後、室温でプレートを凍結解除します。
摂氏95度で10分間インキュベートします。各ウェルに50マイクロリットルのバッファーBを加え、渦を入れ、よく混ぜます。プレートを1、500回gで1分間遠心する。
PCRのDNAとして上清を収集します。まず、1つからDNA上清を使用して、PCRテンプレートと同様に、アニーリング温度を最適化します。各PCRによく試薬とDNA上清の1マイクロリットルを追加します。
PCRチューブを勾配可能な熱ブロックに入れ、原稿に従って加熱プログラムを調整し、各標的断片の最適なアニーリング温度を決定します。PCR産物の電気泳動を1%アガロースゲルで行い、アンプリコンを調べます。ターゲットフラグメントの特異的増幅を可能にする最適なアニーリング温度を決定します。
HRM分析を行うために、HRM適合プレートの各ウェルに1マイクロリットルの蛍光色素と1マイクロリットルのDNA上清を含む試薬を組み合わせます。各プレートには、DNAを含まない1つの野生型の親子サンプルと1つの陰性対照を含む。蒸発を防ぐために、各井戸にミネラルオイルの滴を追加します。
次いで、粘着フィルムでプレートを密封し、遠心分離機を1,000倍gで1分間密封する。最適化されたアニーリング温度を使用して PCR を実行します。次に、粘着フィルムをプレートから取り出し、プレートをHRMマシンに挿入します。
ソフトウェアで、ファイルメニューから「新規実行」を選択するか、画面の上部にある「実行」ボタンを押します。55~95°Cの溶融の開始温度と終了温度を指定します。高解像度の溶解解析用のサンプルを選択し、負のコントロールに類似したサンプルを除外します。
溶ける曲線を正規化して、同じ開始蛍光と終了蛍光を持つようにします。最小値と最大値の低いカーソルがカーブの領域内にあることを視覚的に確認します。デルタF、蛍光の差、デフォルト設定の05のレベルを保ちます。
標準の選択リストから、共通の対バリアントを選択し、通常の感度を選択します。コントロールとしてワイルドタイプを使用するには、H12 を選択します。デルタF値が05より大きいサンプルは、変異植物を含むものと考えられる。
次に、CTAB法を用いて、4つの植物のそれぞれから、野生型とは大きく異なる融解曲線を有する変異型プールからDNAを抽出する。分光光度計を用いて定量した後、NanoDrop 2000でDNAをマイクロリットル当たり約25ナノグラムの最終濃度に調整します。PCRチューブ内のDNAサンプルに0.4マイクロリットルのPCRプライマーを加え、サーマルサイクラーに入れ、ターゲット断片を増幅するようにプログラムを調整します。
次に、シーケンシングのために PCR 製品を会社に送ります。サンガーシーケンシング後、M2植物と野生型の配列を比較して分子病変を比較します。本研究では、OsLCT1またはSPDT遺伝子における変異に対するM2苗のHRMスキャンおよび分析は、ほとんどのサンプルが05未満のデルタFを有する野生型と有意に異なっていない融解曲線を有することが示された。
突然変異体は、それぞれ摂氏90〜92度の温度で05を超えるデルタFsと81.5〜83.5度の大きく異なるHRM曲線を示した。4,560M2の苗からの遺伝子上の変異型および位置を、シーケンシングクロマトグラムによって確認した。OsLCT1の4,304塩基対でGからAへの変異を有するヘテロ接合部位が同定された。
1つの1つのヌクレオチドA挿入は、OsLCT1の4、240塩基対に出現し、TTCトリヌクレオチド欠失は、SPDTの5、948〜5、950塩基対の位置で観察された。HRM 分析の前に PCR を最適化します。ゲル中の染料は少し有害です。
ゲルを動かすときは手袋を着用してください。
