著者は、技術開発や研修への支援のためにビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団に感謝します。

注：このプロトコルは、96ウェルプレート、8チューブストリップ、およびキャピラリーベースのシステム（10μlの反応容量）のためのボリュームと濃度を含み、しかしながら、HRMはまた、それに応じてすべてのボリュームをスケーリングすることにより5μlの反応体積で384ウェルプレートベースのシステムで実行することができます。ほとんどのシステムの検出範囲は、10 ngの鋳型DNAには10pgです。 1.テンプレートを準備します<ol><li>現場調査に参加した患者から得られた全血として格納され、赤血球をペレット化し、またはろ紙上の血液から直接、熱帯熱マラリア原虫のサンプルを得ます。 注：サンプルはまた 、インビトロで成長する培養に適合させることができます。分析のためのいくつかの標準的な実験室株は、マラリア研究およびリファレンス試薬リソースセンター（MR4から注文することができ、サンプルをペレット化し、赤血球または培養物から直接使用するか、または全血、赤血球、またはろ紙から抽出することができます。 </li><li>から抽出したDNAろ紙または培養適合株 注意：HRMは、塩濃度に敏感です。可変抽出方法による濃度差が大きく溶融温度に影響を与えることができます。特定の最終バッファは成功のための重要な要因ではありませんが、標準的な一般的な溶出または再懸濁バッファー（ すなわち 、水、1×TE [&#39;低テ」または「DNA懸濁液バッファー」：10mMのトリス-Cl、0.10 mMのEDTA]を使用しますか、 1×TE [10mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA]）全てのサンプルが異常なまたは矛盾融解曲線を回避するため。 <ol><li>各10μlの反応のための標準的なテ、TE、または水に10 pgの-10 NGあたりμLのテンプレート希釈液を調製します。 </li></ol></li><li>ペレット化した赤血球からの直接増幅<ol><li>薄塗抹顕微鏡を用いて赤血球の寄生虫血症を決定 注：感染した赤血球の寄生虫を決定するための方法は、疾病管理予防センター（CDC）から入手可能であります。http：<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> PCRグレードの水、TEで400、またはTE：0.5％1上記の寄生虫血症を希釈します。それぞれ5〜10μlの反応のために3μLを使用してください。 </li></ol></li><li>コントロール 注：HRM配列が集団12に変異体を検出するための遺伝子走査のために使用することができます。しかし、正確なジェノタイピングは標準シーケンス検証済みSNPを含むことが尋問されている必要があります。既知の遺伝子型を使用することができるとともに、プラスミド構築物またはマラリアは隔離します。ほとんどのアプリケーションでは、3D7（MR4 MRA-151）は、野生型対照として使用します。原因間のランの変動に、常に正と負のコントロールが含まれています。 <ol><li>陽性対照は： - 配列検証済みSNP遺伝子型と1μlのプラスミドの希釈液または標準あたり10 ngの10頁を準備します。 </li><li>増幅反応のための無鋳型対照（NTC）として使用するPCRグレードの水：ネガティブコントロール。 </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2。PCR増幅<ol><li>反応混合物を準備します<ol><li> （オプション）ミネラルオイルオーバーレイ。注：一部のHRMシステムは、スタンドアロンの溶融・プラットフォームであり、増幅の間に結露や製品の蒸発を防ぐために加熱蓋を持っていません。 <ol><li>反応混合物をロードする前に、各ウェルプレートに20μlの軽鉱物油を追加します。 </li></ol></li><li>すべてのアッセイの10倍ワーキングストックを準備します<ol><li>推奨10倍作業ストック濃度と同様にブロックされたプローブベースのHRMジェノタイピングのための最終的な濃度は、表1を参照してください。 </li></ol></li><li>反応混合物を準備します<ol><li>プレートまたはチューブ内の各ウェルに、前方に1μlの10倍の作業ストックを追加して、プライマーおよびプローブ、4.0リバース - 10μlの総反応容量のために5.0μlの2.5倍または2.0倍のHRMマスターミックス、1μlのテンプレート、およびPCRグレードの水を。 </li></ol></li><li>カバープレートまたはチューブ<ol><li>光学板Sを使用しますキャピラリーベースのシステム用のプレートベースの増幅のためのEAL、ストリップチューブ・ベース・システム用の光学キャップ、プラスチックキャップ。カバレッジが完了し、プレートやキャップが完全に密封し、増幅中の蒸発を防ぐために固定されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>スピンサンプル<ol><li>スピンプレート1800×gで3分間、気泡を除去し、鉱油が使用される場合、油相と水相とを分離します。 </li></ol></li></ol></li><li>増幅プロトコール<ol><li>サーマルサイクラーで反応プレートまたはチューブを置きます。ファイル名を指定して実行標準ブロックされたプローブまたはMAAB増幅プロトコール（それぞれ表2、表3）。これらの方法の間のアニール温度の違いに注意してください。 </li></ol></li></ol> 3. HRM解析<ol><li>融液<ol><li> PCR増幅した後、分析を溶融に進みます。内蔵されていません増幅スタンドアロン溶融システム（ 例えば 、BioFire防衛LightScannerシステム）については、再HRM機器におけるサーマルサイクラーと場所から増幅プレートを移動します。プローブとアンプリコンの両方の融解ピークを生成するために80°C - システムソフトウェアインターフェースから、40からプレートを溶かします。 注：溶融および分析時間を節約するために、溶融ウィンドウは単にプローブ又は単位複製配列融解領域のための温度範囲をカバーするように短くすることができます。必要に応じて溶融した後、プレートおよびチューブは再溶融することができ、-20℃または4℃で保存しました。クラッキングからチューブを防ぐ唯一の4℃での保存のガラス管。 </li></ol></li><li>メルト分析<ol><li>陰性サンプルを削除<ol><li>解析ソフトの中では、増幅またはそれはギザギザの融解ピークを持っていなかったさらなる分析試料から取り除きます。注：個々の実行ファイルの解析のモードを選択した後、機器は自動的にグループ正と負のサンプルを。各サブセットの遺伝子型を決定する前に、ユーザーが手動で呼び出しを変更することができます。 <ol><li>融点のいずれかから曲線または融解ピークビュー、曲線を右クリックし、それらを選択するために除去されます。誤分類されたサンプルを選択した後、適切なグループを選択し、クリックして &quot;、新しいコール」に進んで「変更を適用します。」 </li></ol></li></ol></li><li>ノーマライズ<ol><li>温度（-dF​​ / DT）（ &#39;差異曲線&#39;）ビューに関して正規化蛍光の負の微分から、プローブの溶融領域を囲む正規バーを移動します。 注：プローブは、領域が2溶融領域のより低い温度で溶融します。正規のバーは、溶融ピークのベースにする必要があります。 </li></ol></li><li>グループを計算します<ol><li>正規化した後、自動的にグループにサンプルを割り当てるために「計算グループ」を選択します。 特定のグループに必要な場合は、手動で再割り当てサンプル。 注：一部の解析ソフトウェアを変更することはできません高感度のしきい値があります。これらの場合において、複数のoftwareは、視覚的に別のものに属す​​る別のグループにサンプルを割り当てることができます。 </li></ol></li><li>遺伝子型の割り当て<ol><li>標準（陽性対照）に基づいて、グループごとに遺伝子型を割り当てます。 <ol><li> （、正しい変化が誤分類サンプルを選択し、「新しいコール」の横にあるドロップボックスから右のグループを選択してグループ化]タブの下で行われていない場合）、ユーザは計算されたグループが正しいことを確認した後、「編集グループ名を選択グループ &quot;タブ&quot;の下に &quot;。 </li><li>対応する色付きのボックスに標準の遺伝子型を入力します（標準3D7は、既知の遺伝子型を持っており、赤のグループにある場合、例えば、赤のグループは、遺伝子型Aを有し）。 &quot;OK&quot;を押して、結果を保存します。 </li></ol></li></ol></li><li>結果のエクスポート<ol><li>輸出遺伝子型は、さらにサンプル集団の分析のためのスプレッドシートとして呼び出します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

連続HRMはPCR後の分析ステップです。従って、サンプルおよびアッセイセットアップは、高解像度融解工程中に二本鎖の一本鎖DNAへの移行を追跡するために使用される蛍光インターカレート色素の追加の取り込みと、標準的なPCRプロトコールと同様です。成功したHRM分析のための単一の最も重要な要因は、強固なPCR産物です。アッセイ設計が鍵であり、HRMアッセイ設計に最適化されたいくつかのツールは、市販品として、オンライン13可能です。 〜20塩基対を伴う80-150塩基対のアンプリコンの長さは、プローブ領域内のSNPだけでなく、複数のSNPのハプロタイプを区別するために、SNPまたは関心の仕事最良のSNPの上の中心のプローブをブロックしました。プローブは、増幅の間に伸長を防ぐれ、3 &#39;末端にC3スペーサーまたは2塩基対ミスマッチの3&#39;のいずれかを使用してブロックすることができます。プローブは、ワトソンクリックまたはテンプレート鎖と一致するように設計することができます。選択許容可能な融解ピークを生成するプローブ設計を決定するために実験的なテストに依存します。フォワード過剰又はリバースプライマーは、ブロックされたプローブにアニールする一本鎖増幅産物を生成するために使用されます。プローブはフォワード鎖配列が含まれている場合、次に、プライマーが過剰に使用される逆一般的に1：5の比率、およびリバース鎖に一致するプローブに対するその逆。 同様に、HRMは、十分な堅牢なPCR産物に最適です。 PCR反応の最適化は、最適なアニーリング温度を決定するために、勾配PCR及びアガロースゲルまたはバイオアナライザー分析を必要とします。鋳型濃度は、鋳型濃度13を増加させるために 、低プライマー濃度とサイクル数を使用して、すべてのターゲットの前増幅、バイアスされた多重化された増幅のような方法を用いて増加させることができます。 楽器のほんの一握りは、MAABと互換性があります。私使用されるガラスキャピラリー管の熱特性nは、これらのシステムは、この方法を容易にします。毛細血管の小内径並びにガラスを通して急速な熱伝達は、プラスチックの断熱特性に起因するアニーリングおよび変性サイクル間の遅い遷移速度を持つ標準的なPCRプラスチック製品、より厳しい温度制御を提供します。この方法では、検出感度は、野生型と突然変異対立遺伝子10の混合物中の変異体対立遺伝子の1％未満に2-5％から減少させることができます。 HRMは、癌遺伝子変異体のための感染症サーベイランスからのスキャンに、設定や多数の種々の用途にSNP遺伝子型決定のために、容易な、効率的、かつ経済的なツールです。このようなナノロシュとライトサイクラーシステム（480及び96）と同様に、標準的な増幅、リアルタイム、およびコピー数の機能に加えて、エコリアルタイムPCRシステムオファーHRMなどのいくつかの他の楽器、。高スループット機を使用して、HRMのバーコードは、コストレすべての試薬や消耗品など、私たちの手でのアッセイにつき$ 0.50より秒。 ここで説明する文脈では、フィールドベースのアプリケーションは、減少人口の多様性、インポートされた寄生虫の種類の検出、および減少した薬剤感受性と関連するSNPの出現と普及など、マラリア対策の取り組み、関連付けられた変更のためのリアルタイムの人口の監視を可能にします。この方法に改良がマラリアの除去と根絶に向けた進捗状況を通知するための有用な追加の感度を提供します。

マラリアコントロールと撲滅で新たな関心にもかかわらず、マラリアはサハラ以南のアフリカ1において、特に子供、感染の危険性のある世界の人口の半分近く、年間以上55万死亡で、世界的な負担のまま。 これらの新しいコントロールと撲滅プログラムは、配列決定マラリア原虫の大規模な数字で、ゲノムルネッサンスでサポートされていると減少し、薬剤感受性に関連する変異のために分析されている、人口特性2,3のため、毒性を増加させました。一塩基多型（SNP）は、最も一般的に同定された遺伝的変異体4-7の間です。 ポータブルSNPの遺伝子型決定法は、オンサイトとリアルタイム人口監視および追跡8提供しています。個々の寄生虫をフィンガープリントに加えて、「分子バーコード」はまた、対立遺伝子頻度の劇的な時間的なずれを検出するために使用されますだけでなく、分散などの感染9の人口規模と複雑さに有効。 有益なSNPのこのセットは簡単に多くのジェノタイピング・プラットフォームに適合されているが、高解像度は（HRM）の分析は特に敏感と簡単な操作と低コストで新たな変異の検出は、配列決定及び他のと比べて研究を、ベースのフィールドによく適している溶融しますアプローチは資源の乏しい設定で魅力的です。 HRMは、蛍光色素を組み込んだ標準的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で始まります。ポストPCR融解分析は、ピークアンプリコンの融解温度を決定します。短いアンプリコン内の単一のSNPの差は、実質的なピーク融解温度（Tm）の違いをもたらすことができます。 この方法のいくつかの改良が（クラスIV（AT）のSNPを含むSNPを区別し、存在する複数の対立遺伝子を有する試料中のマイナーな突然変異対立遺伝子を検出するために、より良い遺伝子型判定の解像度を提供するポリGenomic感染）。まず、アッセイは、異なる濃度で存在するプライマーを順方向および逆方向に加えて、SNP領域の上に中心短いプローブを組み込みます。これらのブロックされたプローブは、プローブによるテンプレート産物の産生を増加させる非対称のプライマー濃度にPCR中に増幅するが、過剰に産生さ鎖に結合しています。過剰鋳型鎖に結合したプローブからなるこれらの独立した二本鎖アンプリコンは〜20〜30塩基対です。彼らは大幅に10のミスマッチ単一または複数の基地プローブ-テンプレートに関連付けられてはるかに大きなTmの差に全体のアンプリコン（80〜150 bp）のリード線に比べて長さを減少させました。 第二に、変異対立遺伝子増幅バイアス（MAAB）はバイアスに反応アニール温度polygenomic感染の低い比率で存在する突然変異対立遺伝子に向かって反応を低下させます。アニール温度は、完全に一致した（野生型）のTMSおよび不一致（変異体）プローブの間に設定されています秒。この温度では、野生型対立遺伝子の結合は、増幅は、このように両方の単一のサンプル10内に存在する変異対立遺伝子の増幅に向けて付勢、そのミスマッチ同等に比べて阻害されるに十分に安定です。 これらのHRMの改良では、この技術が起源と南米11と1未満に存 ​​在する新たな変異、順番にすぐ隣同士に配置された複数のSNPの分化、および変異の検出に流行感染症に関連する寄生虫の身元の追跡を可能にしましたpolygenomicサンプル10における対立遺伝子の％。 感度の増加は、事前に消去状態と新興薬剤耐性のリスクがあるものに接近する地域では特に重要です。迅速かつ簡単にオンサイト感受性低下に関連するインポート寄生虫やSNPを同定する能力は、サーベイランスと制御プログラムについての通知しますその実装と増加したマラリア撲滅と排除の努力のための識別のホットスポットの有効性。このプロトコルは、増加したHRMジェノタイピング感度のためブロックされたプローブベースとMAABのための方法を説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

撲滅活動の数十年にもかかわらず、マラリアは世界的な負担のまま。地域除去し、グローバル撲滅の最近の新たな関心は、抗マラリア薬に対する感受性の低下に関連する地理的集団の特性だけでなく、変形を含むマラリアの原因とマラリア原虫寄生虫種、約増加ゲノム情報を伴っています。 一つの共通の遺伝的変異、一塩基多型（SNP）は、寄生虫の遺伝子型決定のための魅力的な標的を提供しています。これらのマーカーは、薬剤耐性マーカーを追跡するならず、薬物または他の選択的圧力下でマーカーを用いて寄生虫集団を追跡するだけでなく、有用です。 SNPの遺伝子型決定法は、薬物耐性を追跡するだけでなく、特にeliminatに近づい地域におけるマラリアコントロールの努力に応じて、人口の監視のため、個々の寄生虫を指紋する能力を提供しますイオン状態。 有益なSNPは、特定の遺伝子型決定技術にとらわれないことが確認されているが、高解像度融解（HRM）分析は、フィールドベースの研究に特に適しています。単一標識プローブの個々のSNPを必要とし、複数のゲノム（polygenomic）を含有する試料中のSNPを検出するために、せいぜい10％の感度を提供し、標準的な蛍光プローブベースの方法に比べて、HRMは、2〜5％の感度を提供しています。マイナーアレルの増幅に向けて、このようなブロックされたプローブおよび非対称のプライマー濃度だけでなく、バ​​イアスPCRに増幅アニーリング温度の最適化などのHRMへの変更、さらにHRMの感度を高めます。感度の向上は、特定のアッセイに依存するが、我々は、マイナーな対立遺伝子の1％未満に検出感度が増加しています。 マラリア撲滅に近づい地域では、新興またはインポート薬剤耐性の早期発見は、広報のために不可欠ですOmpT応答。同様に、polygenomic感染を検出し、不可解な地元の貯水池からのインポート寄生虫の種類を区別する能力は、制御プログラムに通知することができます。 この原稿は、患者サンプル中のpolygenomic感染を識別するために、その感度を向上させる高解像度融解技術への変更について説明します。

データは、解析ソフトウェア及び機器に応じて、いくつかの異なる方法で視覚化することができます。一般的に、温度の結果に対する温度（-dF​​ / DT）に対して正規化した蛍光の負の導関数のプロットは、融解ピークを可視化し、遺伝子型を決定するための最も簡単です。 完全溶融ウィンドウ（40℃〜80℃）の両方のアンプリコンおよびプローブ融解領域になります。 図1両方の領域のための正規化された融解ピークの一例を示しています。特定のSNPに対応するピークの明確な差別でちょうどプローブ領域の結果を分析ウィンドウを設定する（ 図2）。 プローブベースの分析は、ホモ接合のSNPのピーク（ 図3）に一致融解温度を有する個々のピークとして両方の対立遺伝子の存在を示しています。 図4はそのprogressiを示していますvely混合対立遺伝子（ 図4B）の集団での変異対立遺伝子のための感受性の増加、その結果、変異対立遺伝子（左側のピーク）（ 図4A）の偏りに増幅（MAAB）の結果の間にアニール温度を低下させます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> 図1.プローブとアンプリコン融解領域。ワイドの両方のプローブ（より低い温度）で溶融ウィンドウ結果と分析することができるアンプリコンの融解ピークを超える温度に対する正規化された蛍光の負の導関数をプロットします。 （ダニエルズらから適応DOI：10.1128 / AAC.05737-11） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2.プローブ融解ピークのSNPの不一致は（グレー）より低い融解温度を有する。パーフェクトマッチ（通常は野生型対立遺伝子）は、より高い融解ピーク（赤）になる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> 図3. Polygenomic融解ピーク。両方の対立遺伝子がサンプル中に存在する場合、プローブベースのHRM解析は、単一の対立遺伝子サンプル（赤とグレー）と一致したピークを持つ2つのピーク曲線（オレンジ色）のように両方の対立遺伝子を表しています。 （ダニエルズらから適応DOI：10.1128 / AAC.05737-11） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">より大きいVを表示するには、こちらをクリックしてください</a>この図のERSION。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> 図4.変異対立遺伝子増幅バイアス（MAAB）。A.次第に増幅アニーリング温度を低下させることがpolygenomicまたはpolyallelic試料中の変異体（より低い温度）対立遺伝子に対応するピークに向かって融解ピーク反応を付勢します。 B. MAABはpolygenomicまたはpolyallelicサンプル中の1％未満で存在するマイナー対立遺伝子を検出するために、HRMの感度になります。 （パートBはダニエルズらDOIから適応：10.1128 / AAC.05737-11） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> プローブベースの高解像度融解増幅反応の表1.セットアップ。 <table><tbody><tr><td>成分</td><td>再あたりの体積アクション（96ウェルプレートおよびキャピラリーチューブ） </td><td>反応あたりのボリューム（384ウェルプレート） </td><td>最終濃度</td></tr><tr><td> HRMマスターミックス</td><td> 4-5μL </td><td> 2〜2.5μlの</td><td> 1× </td></tr><tr><td> 10×過剰プライマー</td><td> 1μL </td><td> 0.5μlの</td><td> 0.50μM </td></tr><tr><td> 10×その他のプライマー</td><td> 1μL </td><td> 0.5μL </td><td> 0.1μM </td></tr><tr><td> 10倍のプローブ</td><td> 1μL </td><td> 0.5μlの</td><td> 0.40μM </td></tr><tr><td> PCRグレードの水</td><td> 1-2μL </td><td> 0.5-1μL </td><td></td></tr><tr><td>テンプレートDNA </td><td> 1μL </td><td> 0.5μlの</td><td> 0.01〜10 ngの/μL </td></tr><tr><td></td><td> 10μlの</td><td> 5μL </td><td></td></tr></tbody></table> 表2 StandarD高解像度融解増幅条件。 <table><tbody><tr><td>温度</td><td>時間</td></tr><tr><td>ホールド</td><td> 95°C </td><td> 120秒</td></tr><tr><td rowspan="2"> 45サイクル</td><td> 95°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td> 68°Cの* </td><td> 30秒</td></tr><tr><td rowspan="2"> 1サイクル</td><td> 95°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td> 28°C </td><td> 30秒</td></tr></tbody></table> *この温度は、アンプリコンに依存します 変異対立遺伝子の増幅偏り表3.増幅条件。 <table><tbody><tr><td>温度</td><td>時間</td><td>サイクル</td><td>ランプ速度</td><td>取得モード</td><td>分析モード</td></tr><tr><td>変性</td><td> 95°C </td><td> 30秒</td><td> 1 </td><td> 20 </td><td>なし</TD&gt; <td>なし</td></tr><tr><td rowspan="2">サイクル</td><td> 95°C </td><td> 2秒</td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td>なし</td><td rowspan="2">定量</td></tr><tr><td> 56°Cの* </td><td> 15秒</td><td> 20 </td><td>シングル</td></tr><tr><td rowspan="3">融液</td><td> 40°C </td><td> 0秒</td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td>なし</td><td>なし</td></tr><tr><td> 45°Cの* </td><td> 0秒</td><td rowspan="2">連続</td><td rowspan="2">融液</td></tr><tr><td> 90°Cの* </td><td> 0秒</td></tr></tbody></table> *この温度は、アンプリコンに依存し、MAABを行う際に削減されます

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Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

高解像度融解分析は、不均一な集団中の単一塩基多型を区別する能力を提供するが、変異対立遺伝子の増幅偏りは、試料内の比較的低い割合で存在する対立遺伝子を検出する能力を高めることができます。このプロトコルは、高分解能融解分析の感度を向上させる改良が記載されています。

マラリアに一塩基多型のジェノタイピングを溶融高解像度の感度を上げる方法

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.5K ビュー.  Harvard University. 高解像度融解分析は、不均一な集団中の単一塩基多型を区別する能力を提供するが、変異対立遺伝子の増幅偏りは、試料内の比較的低い割合で存在する対立遺伝子を検出する能力を高めることができます。このプロトコルは、高分解能融解分析の感度を向上させる改良が記載されています。 

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Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

免疫・感染学

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

定性的にオーバーレイアッセイを使用すると、肺炎球菌バクテリオシンに対する細菌の産生と感度を測定します

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

の高分解能電子顕微鏡<em&gt;ヘリコバクター·ピロリ</em鉄の可用性の変化する条件で生産&gt; CAG IV型分泌系線毛

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

血液処理のための迅速な方法は、ヒト血液中の血漿ペプチドレベルの収量を増やすには

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

マラリアに一塩基多型のジェノタイピングを溶融高解像度の感度を上げる方法

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アン

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