成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

このプロトコルは、種子が崩れないようにそのままスライスすることを可能にし、ピペットチップに収まる種子のデンプン顆粒の視覚化を可能にする。可鍛性プラスチックコーンは乾燥組織や臓器のネイティブ構造をサポートしているので、この安価で簡単なマニホールドは、多くのサンプルを短時間で処理することができます。ここでの法医学的顕微鏡の利点から、耐性デンプン、私たちが探している何か、その生デンプンへの酵素のアクセシビリティ、アミロリシス、血糖指数、およびグルコーススパイクから進むために、これらは今日世界中で2型糖尿病と戦うためにより良い米品種を繁殖するためのコアパラメータです。

そして今、それはあなたに博士キアバートンを紹介することは大きな喜びです。Dr.Bartonは私たちの研究室の出身で、教員のコアイメージング施設を使用して、この技術がどのように展開されているかを示します。まず、乾燥したカーネルを脱ハッシュします。

作業台の平らなゴム製ストッパーに単一のカーネルを置き、このストッパーが静止したままであることを確認します。2番目の平らなゴム栓を使用して、最初のゴム栓に対してカーネルをねじってカーネルを磨き、その後、カーネルから殻を取り除き、胚乳を粉砕したり、2つのゴムバングの間であまりにも積極的に種子を粉砕しないように注意してください。微細な鉗子を使用して残りの殻を取り除き、個々の殻付きカーネルをプラスチック250マイクロリットルピペットチップに挿入します。

カーネルの胚端がピペット先端の円錐の端に向かっていることを確認します。2番目の250マイクロリットルピペットチップを挿入して、カーネルを最初のピペットチップに押し込み、切り離し中にカーネルを不動に保ち、カーネルを損傷したり、2番目のピペットチップを曲げたりしないようにします。ワークベンチにピペットチップの組み立てを平らに置き、手で所定の位置に保持します。

一方、鋭いメスの刃を使ってカーネルの中央をスライスし、ピペットチップの端を切り落とします。アセンブラージュを下にスライスし、手のセクションの2つの新しい露出した面が平行になるようにメスの刃を垂直に向けます。その後、メスを使用して、米カーネルの厚さ1ミリメートルの部分をカットします。

反射光顕微鏡を行う場合は、横米のセクションを重いゲージの黒い紙の上に置きます。斜めの照明のための取り付けられたグースネックを用いたステレオ顕微鏡を使用して、少なくとも10倍の倍率を使用して、横断部の光画像を取得します。野生型の日本裸とssg1のセクションを260回、920倍、4,200倍の倍率で調べた。

適切に調製すると、米の部分は約0.9ミリメートルの厚さで、子宮内精子と無傷のpericarpおよびaleurone層の粉砕を最小限に抑えた。この技術は、全ての胚乳細胞、化合物デンプン顆粒、および個々のサブ顆粒を観察するのに十分な品質のセクションの調製を可能にする。野生型耐性デンプンハイブリッドライン、Zhehui 7954およびコバルト生成変異体RS111などの半透明のカーネル生産者は、通常の米の内胚花表現型である密閉された多面体デンプン顆粒を密に詰めた。

チョーク状のカーネル生産者、商業品種のYe TangとRS4のSEM画像は、丸くて緩く詰め込まれたデンプン顆粒を表示しました。野生型Xiushiu11とその変異型KMD1は、昆虫の摂生を阻害するCry1Ab遺伝子を発現し、半透明の耐性デンプンラインと同様の切片および子宮内精子形態型を有していた。この技術は、他の種の種子に適用することができます。

モデルのモノコット、ブラキポエテ・ディスタキオンは非常に硬い種子を作り出すが、それでも無傷の横断セクションを得ることが可能であった。無傷の横切りは、柔らかい白い冬の小麦からも製造されました。生物学的構造の内部を見るためのこの急速で安価なスクリーニング方法は、昆虫の足、イカのBeanの木のスパイク、サンザシ、魚の棘、またはこのサンプルサポートセットアップから利益を得ることができる法医学顕微鏡の任意の分野に適用することができます。

このプロトコルを実行した後、電気顕微鏡用のスパッタコーティング、特定の蛍光色素による染色、および変異オート麦および大麦線のβグルカン細胞壁厚さへのカルカフルターの塗布は、迅速な表現型スクリーニングで植物の繁殖に近づくいくつかの迅速な方法です。