シトシン・グアニン・グアニン・トリヌクレオチドを脆弱なX精神遅滞-1遺伝子で繰り返す堅牢なポリメラーゼ連鎖反応性アッセイ

この費用対効果の高い方法は、FXSおよび脆弱X関連疾患の分子診断およびスクリーニングにおける幅広い用途を見つけることができます。それはターンアラウンドタイムで速く、機器への投資が少ないです。当社のPCRベースのアッセイは、中級、プレミューテーション、および堅牢性と迅速な報告時間を含むFXSおよび脆弱X関連障害の完全スペクトルの分類を容易にします。

この手順は、パーキンエルマーシンガポールのウェンチュアによって実証されます。まず、PCR バッファー ミックス、サンプル希釈剤、および DNA サンプルを 20°C の冷凍庫から取り出し、室温で 20 ~ 30 分間放置して解凍します。試薬を使用する前に、渦を短く回転させます。

分光光度計でDNAサンプル濃度を測定し、必要に応じて、サンプル希釈液で1マイクロリットル当たり25ナノグラムに希釈します。PCR プレートのウェルにラベルを付けて、参照およびテスト済みの DNA サンプルを特定し、テスト、参照、および陰性コントロール サンプルに必要な反応数を計算します。PCR バッファーミックス 15 マイクロリットルを 0.6 マイクロリットルのサンプル希釈液と 0.4 マイクロリットルのポリメラーゼを各反応に組み合わせて、PCR マスターミックスを準備します。

ミックスを渦し、それを回転させます。その後、各ウェルに混合物の18マイクロリットルを分配します。次に、各DNAの2マイクロリットルを適切なウェルにピペットします。

試薬を上下に5回ピペットして混ぜ、プレートを密封します。プレートをサーモサイクラーに入れ、原稿の指示に従ってPCRを実行します。インキュベーター シェーカーを摂氏 65 度に予熱し、各 PCR 製品に 80 マイクロリットルの 1X TE バッファーを加えます。

マルチチャンネルピペットを使用して、サンプルをPCRクリーンアッププレートに移し、プレートをシェーカーに入れます。1200 RPMで10分間振りながら、摂氏65度でインキュベートします。インキュベート後、インキュベーターシェーカーを摂氏25度まで冷やし、真空計器を250ミリバールに設定し、フィルターを通して溶液を吸引します。

15分後、井戸には液体が残っていないはずです。真空をオフにし、各ウェルに1X TEバッファの50マイクロリットルを追加します。以前の真空設定を使用して10分間溶液を吸引します。

フィルタープレートの底部をペーパータオルの積み重ねにしっかりと押し付けて乾燥させ、各ウェルの底中央に20マイクロリットルの1X TEバッファーを加えます。プレートをシェーカーに入れ、1200 RPMで5分間振りながら摂氏25度でインキュベートします。インキュベーション後、精製PCR産物の少なくとも15マイクロリットルを新鮮な96ウェルPCRプレートに移します。

始める前に、DNA色素濃縮物、DNAゲルマトリックス、DNAマーカー、DNAラダー、精製DNAサンプルを室温に戻します。シリンジを交換してベースプレートを調整してプライミングステーションを設置し、シリンジクリップのレバーを離して上の位置にスライドさせます。サイジングソフトウェアを起動し、ゲル染料ミックスを準備します。

染料が10秒間濃縮され、それを回転させます。次に、25マイクロリットルの色素をゲルマトリックスバイアルに加え、溶液をボルテックスして混合する。ゲル染料ミックスをスピンフィルターに移し、遠心分離機に入れ、1500回gで10分間回転させます。

ゲル染料ミックスをロードする準備ができたら、プライミングステーションに新しいDNAチップを挿入し、9マイクロリットルのゲル染料ミックスをG.Closeプライミングステーションでマークされたウェルに追加し、プランジャーが1ミリリットルのマークに配置されていることを確認します。クリップが押し続くまで、シリンジプランジャーを押し下げます。正確に 30 秒待ってから、クリップを放します。

さらに5秒間待ってから、プランジャーを1ミリリットルの位置にゆっくりと引き戻します。プライミングステーションを開き、9マイクロリットルのゲル染料をG.でマークされた井戸に追加し、5マイクロリットルのマーカーをラダーシンボルと12のサンプルウェルのそれぞれに追加します。ラダーシンボルを使用して、1マイクロリットルのラダーを、サンプルウェルにPCR製品または水を1マイクロリットル加えます。

2400 RPMで1分間、チップをボルテックスします。それをバイオアナライザに挿入し、5分以内にチップを実行します。実行が完了したら、ピークデータを csv テーブルファイルとしてエクスポートします。

プリミューテーション雌試料および完全変異雌試料を参照サンプルとして使用する。フラグメントサイズプロファイルには上下のマーカーピークが含まれており、通常は約95塩基対でプライマー複合ピークがあります。これらの参照サンプルは、回帰標準曲線の構築に使用されます。

次に、線形回帰標準曲線を使用して、未知のサンプルの繰り返しサイズを計算します。臨床正常、中間、前突然変異、完全突然変異、およびモザイク完全突然変異サンプルは、この方法で正しく分類することができる。場合によっては、マイクロ流体電気泳動の結果には1つのピークしか表示されませんが、これは正常なホモ接合対立の存在による可能性が高いです。

最適でない結果の 1 つのタイプは、ベースライン バイアスであり、あいまいまたは解釈不能であり、機器の誤動作が原因と考えられます。この手順を試みる際には、プロトコルを開始する前に、適切な量のDNAと品質を確保することが重要です。FMR1遺伝子シーケンシングは、AGG中断パターンを同定するために行うことができる。

メチル化感受性制限酵素またはバイスルフィド修飾アッセイは、メチル化状態を監視するために使用できる。これは、高速で堅牢でコスト効率の高い手法です。これは、FXSおよび脆弱X関連疾患のキャリア状態に関する人口ベースの研究を行う際に他の研究者を支援します。