Этот экономически эффективный метод может найти широкое применение в молекулярной диагностике и скрининге FXS и хрупких X-связанных расстройств. Это быстрое время оборота и меньше инвестиций в оборудование. Наш анализ на основе ПЦР может облегчить классификацию полного спектра FXS и хрупких X-ассоциированных расстройств, включая промежуточные, предмутационные и полные мутации с надежностью и быстрым временем отчетности.
Процедуру продемонстрирует Венг Чуа из PerkinElmer Singapore. Начните с удаления буферной смеси ПЦР, разбомбовки образцов и образцов ДНК из морозильной камеры 20 градусов по Цельсию и оставляя их при комнатной температуре от 20 до 30 минут до оттепели. Перед использованием реагентов, вихрь и кратко спина их вниз.
Измерьте концентрацию образца ДНК с помощью спектрофотометра и при необходимости разбавьте его до 25 нанограмм на микролитер с разбавлением образца. Наклейте этикетку колодцев пластины ПЦР для выявления эталонных и проверенных образцов ДНК и расчета количества реакций, необходимых для анализа, ссылки и отрицательных контрольных образцов. Подготовьте мастер-микс ПЦР, объединив 15 микролитров буферной смеси ПЦР с 0,6 микролитров разбомбивания образца и 0,4 микролитров полимеразы для каждой реакции.
Vortex смесь и спина его вниз. Затем вылейте 18 микролитров смеси в каждую колодец. Затем пипетка два микролитров каждой ДНК в соответствующий колодец.
Смешайте реагенты, трубя вверх и вниз пять раз, а затем запечатать пластину. Поместите пластину в термоциклер и запустите ПЦР в соответствии с рукописными указаниями. Разогреть инкубатор шейкер до 65 градусов по Цельсию и добавить 80 микролитров 1X TE буфера для каждого продукта ПЦР.
Используйте многоканальный пипетку для передачи образцов на пластину очистки ПЦР и положите пластину в шейкер. Инкубировать его при 65 градусах по Цельсию при встряхивании при 1200 об/мин в течение 10 минут. После инкубации охладите шейкер инкубатора до 25 градусов по Цельсию, установите вакуумный инструмент до 250 миллибар и оспирировать раствор через фильтр.
Через 15 минут скважины не должны иметь жидкости. Выключите вакуум и добавьте 50 микролитров буфера 1X TE к каждой колодец. Аспирировать раствор в течение 10 минут с помощью предыдущих параметров вакуума.
Высушите нижнюю часть фильтровальной пластины, нажимая ее твердо на стопку бумажных полотенец, а затем добавьте 20 микролитров буфера 1X TE в нижний центр каждой хорошо. Поместите тарелку в шейкер и инкубировать при 25 градусах по Цельсию при встряхивании при 1200 об/мин в течение пяти минут. После инкубации перенесите не менее 15 микролитров очищенного ПЦР-продукта на свежую 96 хорошо ПЦР пластину.
Перед началом довезение концентрата красителя ДНК, матрицы геля ДНК, маркера ДНК, лестницы ДНК и очищенных образцов ДНК до комнатной температуры. Настройка грунтовки станции путем замены шприца и регулировки базовой пластины, а затем освободить рычаг шприц клип и сдвиньте его в верхнее положение. Запустите программное обеспечение размеров и подготовить смесь красителя геля.
Vortex красителя концентрата в течение 10 секунд, а затем спина его вниз. Затем добавьте 25 микролитров красителя в гель матричный флакон и вихрь раствор для смешивания. Перенесите смесь гелеобразного красителя в спиновой фильтр, поместите его в центрифугу и закрутите в течение 10 минут при 1500 г.
Когда готовы загрузить гель красителя смесь, вставьте новый чип ДНК в грунтовке станции и добавить девять микролитров смеси красителя геля в колодец, который отмечен G.Close грунтовки станции и убедитесь, что поршень расположен на один миллилитр знака. Нажмите шприц поршень вниз, пока он не проводится клип. Подождите ровно 30 секунд, а затем отпустите клип.
Подождите еще пять секунд, а затем медленно потяните поршень обратно в одно миллилитрное положение. Откройте грунтовку станции и добавить девять микролитров смеси гелего красителя в скважины отмечены G.Add пять микролитров маркера в хорошо отмечены символом лестницы и каждый из 12 образцов скважин. Добавьте один микролитр лестницы к колодце с символом лестницы и один микролитр продукта ПЦР или воды в пробные скважины.
Vortex чип в течение одной минуты при 2400 об/мин. Вставьте его в биоанализ и запустите чип в течение пяти минут. Когда запуск будет завершен, экспорт пиковых данных в качестве файлов таблицы csv.
В качестве эталонных образцов используются предмутационный женский образец и полная мутация женского образца. Верхний и нижний пик маркера включены в профиль размера фрагмента, и, как правило, грунтовка сложный пик около 95 базовых пар. Эти эталонные образцы используются для построения стандартной кривой регрессии.
Стандартная кривая линейной регрессии затем используется для расчета повторных размеров неизвестных образцов. Клинические нормальные, промежуточные, премутационные, полные мутации и мозаичные полные образцы мутаций можно правильно классифицировать с помощью этого метода. В некоторых случаях только один пик отображается в результатах микрофлюидного электрофореза, что, вероятно, связано с наличием нормальных гомозиготных аллелей.
Одним из видов неоптимальных результатов является базовая предвзятость, которая может быть неоднозначной или неинтерпретуальной и, как подозревается, вызвана неисправностью прибора. При попытке этой процедуры, важно обеспечить соответствующее количество ДНК и качества перед запуском протокола. Секвенирование гена FMR1 может быть выполнено для определения шаблона прерывания AGG.
Для мониторинга состояния метилирования можно использовать фермент ограничения метилирования или анализ модификации бисульфида. Это быстрый, надежный и экономически эффективный метод. Это поможет другим исследователям в проведении населения на основе исследования о статусе носителя FXS и хрупких X-связанных расстройств.
