Questo metodo conveniente può trovare ampie applicazioni nella diagnosi molecolare e nello screening di FXS e disturbi fragili correlati all'X. È veloce nel tempo di consegna e meno investimenti in attrezzature. Il nostro test basato su PCR può facilitare la classificazione dell'intero spettro dei disturbi associati a FXS e Fragile X, tra cui intermedio, premutazione e mutazione completa con robustezza e tempi di segnalazione rapidi.
La procedura sarà dimostrata da Weng Chua di PerkinElmer Singapore. Inizia rimuovendo la miscela tampone PCR, il diluente del campione e i campioni di DNA dal congelatore Celsius di 20 gradi e lasciandoli a temperatura ambiente per 20-30 minuti per scongelarli. Prima di usare i reagenti, vortice e farli girare brevemente verso il basso.
Misurare la concentrazione del campione di DNA con uno spettrofotometro e, se necessario, diluirla a 25 nanogrammi per microlitro con diluente del campione. Etichettare i pozzi di una piastra PCR per identificare campioni di DNA di riferimento e testati e calcolare il numero di reazioni necessarie per i campioni di test, riferimento e controllo negativo. Preparare il mix master PCR combinando 15 microlitri di miscela tampone PCR a 0,6 microlitri di diluente campione e 0,4 microlitri di polimerasi per ogni reazione.
Vortice il mix e spin it down. Quindi erogare 18 microlitri della miscela in ogni pozzo. Quindi pipettare due microlitri di ogni DNA nel pozzo appropriato.
Mescolare i reagenti tubazioni su e giù cinque volte, quindi sigillare la piastra. Posizionare la piastra nel termociclo e far funzionare la PCR in base alle indicazioni del manoscritto. Preriscaldare lo shaker dell'incubatore a 65 gradi Celsius e aggiungere 80 microlitri di tampone 1X TE a ciascun prodotto PCR.
Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire i campioni su una piastra di pulizia PCR e mettere la piastra nello shaker. Incubarlo a 65 gradi Celsius mentre trema a 1200 giri/min per 10 minuti. Dopo l'incubazione, raffreddare lo shaker dell'incubatore fino a 25 gradi Celsius, impostare lo strumento a vuoto su 250 millibar e aspirare la soluzione attraverso il filtro.
Dopo 15 minuti, i pozzi non dovrebbero avere più liquido. Spegnere il vuoto e aggiungere 50 microlitri di tampone 1X TE a ciascun pozzo. Aspirare la soluzione per 10 minuti utilizzando le impostazioni di vuoto precedenti.
Asciugare la parte inferiore della piastra filtrante premendola saldamente su una pila di tovaglioli di carta e quindi aggiungere 20 microlitri di tampone 1X TE al centro inferiore di ogni pozzo. Posizionare la piastra nello shaker e incubare a 25 gradi Celsius mentre si trema a 1200 giri/min per cinque minuti. Dopo l'incubazione, trasferire almeno 15 microlitri del prodotto PCR purificato su una piastra PCR fresca da 96 po'.
Prima di iniziare, porta il concentrato di colorante del DNA, la matrice del gel di DNA, il marcatore del DNA, la scala del DNA e i campioni di DNA purificati a temperatura ambiente. Impostare la stazione di adescamento sostituendo la siringa e regolando la piastra di base, quindi rilasciare la leva della clip della siringa e farla scorrere nella posizione superiore. Avviare il software di dimensionamento e preparare il mix di coloranti in gel.
Vortice il concentrato di colorante per 10 secondi, quindi girare verso il basso. Quindi, aggiungere 25 microlitri del colorante a una fiala a matrice di gel e vortice la soluzione da mescolare. Trasferire la miscela di coloranti in gel su un filtro di rotazione, posizionarla nella centrifuga e ruotarla per 10 minuti a 1500 volte g.
Quando si è pronti a caricare la miscela di coloranti in gel, inserire un nuovo chip DI DNA nella stazione di adescamento e aggiungere nove microlitri della miscela di coloranti in gel nel pozzo contrassegnato con G.Chiudere la stazione di adescamento e assicurarsi che lo stantuffo sia posizionato a un segno di millilitro. Premere lo stantuffo della siringa verso il basso fino a quando non viene trattenuto dalla clip. Attendere esattamente 30 secondi, quindi rilasciare la clip.
Attendere altri cinque secondi, quindi tirare lentamente lo stantuffo nella posizione di un millilitro. Aprire la stazione di adescamento e aggiungere nove microlitri di miscela di coloranti in gel nei pozzi contrassegnati con G.Aggiungere cinque microlitri di marcatore nel pozzo contrassegnato con un simbolo di scala e ciascuno dei 12 pozzi campione. Aggiungere un microlitro della scala al pozzo con il simbolo della scala e un microlitro del prodotto PCR o dell'acqua ai pozzi campione.
Vortice il chip per un minuto a 2400 giri/min. Inseriscilo nel bioanalizzatore ed esegui il chip entro cinque minuti. Al termine dell'esecuzione, esportare i dati di picco come file di tabella CSV.
Un campione femminile di premutazione e un campione femminile a mutazione completa vengono utilizzati come campioni di riferimento. Un picco marcatore superiore e inferiore sono inclusi nel profilo delle dimensioni del frammento, e di solito c'è un picco complesso di primer a circa 95 coppie di basi. Questi esempi di riferimento vengono utilizzati per costruire una curva standard di regressione.
La curva standard di regressione lineare viene quindi utilizzata per calcolare le dimensioni ripetute di campioni sconosciuti. I campioni clinici normali, intermedi, di premutazione, mutazione completa e mosaico di mutazione completa possono essere classificati correttamente con questo metodo. In alcuni casi, solo un picco viene visualizzato nei risultati dell'elettroforesi microfluidica, che è probabilmente dovuta alla presenza di normali alleli omozigoti.
Un tipo di risultato non ottimale è la distorsione di base, che può essere ambigua o non interpretabile, ed è sospettata di essere causata da malfunzionamento dello strumento. Quando si tenta questa procedura, è importante garantire una quantità appropriata di DNA e qualità prima di iniziare il protocollo. Il sequenziamento genico FMR1 può essere eseguito per identificare il modello di interruzione AGG.
E l'enzima di restrizione sensibile alla metilazione o il saggio di modifica del bisolfito possono essere usati per monitorare lo stato di metilazione. Questa è una tecnica veloce, robusta ed economica. Aiuterà altri ricercatori a condurre uno studio basato sulla popolazione sullo stato portante di FXS e disturbi fragili associati all'X.
