膜トランスポーターを特徴付けるためのこの技術の主な利点の1つは、特定の基質に対するトランスポーターの相対的な親和性を決定し、輸送メカニズムに関する洞察を得ることができることです。タンパク質勾配を利用して基質輸送を駆動する膜タンパク質の特性評価は、ここで示すこの裏返しの小胞アッセイに特に適しています。このアッセイには、フランスのプレスや超遠心分離機へのアクセスなどの特殊な機器が必要ですが、膜トランスポーターを人工リポソームに再構成する必要があるアッセイよりも技術的に簡単である可能性があると考えています。
この技術の主な利点は、異なる基質の相対的な親和性を定量化し、競合する基質が輸送格子に及ぼす影響をテストするために競合アッセイを行うことができる点です。このアッセイを説明するために使用されるBAT1トランスポーターの場合、アルギニンによるトランスポーターの基質活性化を示すこともできた。この手順を開始するために、適切な抗生物質を用いてポリアミン3培地の5ミリリットルで単一コロニーを接種し、摂氏37度で一晩成長させることによって標的タンパク質を発現する調製された大腸菌変異細胞を培養する。
翌日、この培養液を0.0002%アラビノースで補充された新鮮なポリアミン3培地の500ミリリットルに移し、細胞培養が0.6~0.8のOD600に達するまで増殖する。この後、遠心分離機はGの2000倍、摂氏4度で15分間、細胞ペレットを採取する。ペレットを再び懸濁し、バッファー1で3回、2000倍Gで遠心し、摂氏4度で毎回15分間洗浄します。
3回目のスピンの後にバッファ1の細胞の最終体積は10ミリリットルでなければなりません。35ミリリットルのフランスの圧力セルをセットし、細胞の体に細胞の懸濁液を注ぎます。ユニットの背面にあるRHSのスイッチでマシンの電源を入れ、レシオセレクタスイッチを高に設定します。
ポンプスイッチをオンにします。ピストンは、チャンバー内の空気を置き換えるためにベースから上昇し始めます。ゲージが640 PSIに達するまで圧力上昇弁を時計回りに回して圧力を上げます。
これにより、10,000 PSI の内部圧力が作成されます。セルが目標圧力に達したら、フローバルブアセンブリを反時計回りに回して少し開きます。弁の開口を調整して、毎分約10滴の流量を可能にします。
ピストン本体の停止線がフローセルの上部に到達すると、ポンプスイッチがオフになります。レシオセレクタスイッチを下に置いて下げ、ポンプスイッチをオンにします。底板が完全に引き込まれたら、圧力上昇弁を完全に反時計回りに回して、システム圧力をゼロに減らします。
ポンプスイッチをオフにして、機械の電源を切ります。遠心分離フランスのプレス溶出物はGの10,000倍、摂氏4度で15分間、切れ目のない細胞や細胞の破片を取り除きます。ペレットを捨てて、上清を超遠心チューブに移します。
超遠心伏せは、得られた上清を150,000倍Gで、摂氏4度で1時間膜小胞をペレットする。膜小胞をバッファー2に再懸濁せずに1回洗浄します。次いで、ダンス組織粉砕機を使用して、2つの緩衝液中の膜小胞を再懸濁させる。
1.5ミリリットル遠心管で膜調製物の100マイクロリットルのアリコートを調製し、マイナス80°Cで保存します。まず、0.1ミリモルの塩化コバルトを含むpH 7.8でトリスの30ミリモルで小胞を洗浄し、再中断します。カルボキシペプチダーゼAを塩化ナトリウム、トリス、塩化コバルトIIに1マイクロリットルずつ加えて、各100マイクロリットルのサンプルに加えます。
摂氏20度で20分間インキュベートします。消化を止めるために、ナトリウムEDTAと2-メルカプトエタノールを含む溶液を5マイクロリットル加え、PH 7.5で消化を止めます。溶液を室温で1時間インキュベートし、酵素を完全に不活性化します。
次に、5~10マイクロリットルの溶液を5~10マイクロリットルの間で加え、pH 7.5~100マイクロリットルのサンプルで、5~10マイクロリットルの溶液をサンプルで分析し、電気泳動によりサンプルを分析します。アミノブロッティングを行うために、ポリアクリルアミドゲルに25ミリモルリン酸水素ナトリウムを湿らせたニトロセルロースフィルターを置く。2つの湿らせたセルロースフィルターの間にこれらを置き、最後に、2つの湿らせたプラスチック製の精練パッドの間に置きます。
25ミリモルリン酸水素ナトリウムを含むチャンバーの電極の間にこの集合体を2〜4°Cの温度で置きます。20ボルトでタンパク質を電気伝達し、2〜3アンペアで3時間タンパク質を電気伝達する。ニトロセルロース膜を摂氏2度で一晩ブロッキングバッファでブロックします。
翌日、抗ヒスC末端HRP抗体の20ミリリットル~5,000希釈、ブロッキングバッファーを2時間培養し、50ミリリットルのバッファーで合計60分間洗浄します。アミノブロットを可視化するには、変性アルコールの20ミリリットルに4-クロロ-1-ナフトールの6ミリグラムを溶解し、15ミリモルトリスの80ミリリットルと30%過酸化水素の50マイクロリットルを追加します。この基板溶液中の濾紙を20分間浴びる。
十分な色が発達したら、膜を水ですすいで乾かします。まず、100マイクロリットルの膜小胞を摂氏12度で5分間インキュベートします。放射性標識ポリアミンを含むバッファー3を50マイクロモルの最終濃度で膜小胞に加え、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで輸送を開始する。
1分間摂氏12度で輸送アッセイを行います。この後、反応混合物を濾過マニホールドに移し、0.45マイクロメートルのニトロセルロース膜フィルターを通して濾過します。10倍高濃度の非標識ポリアミンを含む氷冷アッセイバッファーを3ミリリットル加え、ポリアミンを含まないアッセイバッファーを3ミリリットル加え、非特異的結合を低減します。
洗浄したフィルターを、10ミリリットルのシンチレーション液を含む20ミリリットルの使い捨てシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーションカウンターを使用して放射能を決定する。テキストプロトコルで概説されているように、正味ポリアミンの取り込み値を計算します。標的タンパク質を発現する小胞への放射性標識基質の取り込み量を測定し、非線形回帰法を用いてミカニス・メンテン動態を計算することにより、基質のKmを決定する。
競技実験では、アッセイバッファーで作られた非標識競合基板を12°Cの小胞100マイクロリットルを含む遠心管に加え、同時に50マイクロモルの放射性標識ポリアミンを添加する。先に説明したように小胞の中に閉じ込められた放射能を測定する。放射性標識ポリアミンの取り込みと100マイクロモル以上の非標識基板の存在を測定し、非線形回帰法を使用して曲線をプロットすることにより、競合基板の親KMを決定します。
この研究では、抗ポーターは、まず大腸菌でタンパク質を発現し、次に異種発現タンパク質を無細胞系でアッセイできるように膜小胞を生成することを特徴とする。ウェスタンブロットは、AtBAT1が小胞に転置されていることを確認するために使用されます。抗HisC末端抗体でブロットを調査すると、約72.3キロダルトンの融合構築タンパク質が明らかになった。
SDS-PAGEより前の小胞の消化は減少をもたらしたが、プローブ信号の完全な損失ではなかった。摂氏12度では、小胞による放射性標識されたスペルミジンの取り込みは1分で最も高く、3分間にわたって直線的であった。従って、輸送アッセイのためのインキュベーション時間は1分に固定される。
1分後、小胞膜全体にプロトン勾配がないため、pH 8.0で調製され保存された膜小胞による同位体の正味取り込みはありません。人工プロトン勾配の散逸の効果を実証するために、膜小胞は標識された基質の付加の前に10分間pH 8.0バッファーでインキュベートされ、放射標識された基質の最小取り込みにつながる。まとめると、これらの結果は、スペルミジンのプロトン駆動の取り込みがBAT1タンパク質によるものであることを示している。
タンパク質の基質特異性を決定するために、Km値は、異なる濃度での放射性標識基質の取り込み量を測定することによって計算される。スペルミジン、プトレシン、アルギニンのKm値は、このタンパク質が高親和性ポリアミンおよびアルギニン交換器であることを示しています。特定の基質に対するトランスポーターの親和性は、競争アッセイを用いて間接的に決定することもできる。
これらのアッセイは、GABAがスペルミジンの競合性阻害剤であることを明らかにします。さらに、異なるアミノ酸の様々な濃度の存在下で放射性標識されたスペルミジンの50マイクロモルの取り込みの取り込み量を測定すると、AtBAT1はミリモル濃度でグルタミンおよびアラニンを輸送できることも明らかになる。この手順を行う場合、膜トランスポーターを細菌膜に集積することは、明らかに、重要である。
目的のタンパク質が膜に統合されていることを確認するには、C末端タグに対する抗体を使用して行うことができます。ヒトトランスポーターの遺伝的変異は、特定のトランスポーターの基質である代謝産物および薬物の輸送に影響を及ぼす可能性がある。したがって、アグリスの変動は、薬物の取り込みおよび排泄の両方に影響を及ぼす可能性がある。
多くの対立遺伝子変異体は、発現ベクターにおけるトランスポーター遺伝子の左右方向変異生成によって迅速に作製することができる。これらの変異体の機能アッセイは、その後、内部のベシクルアッセイを使用して非常に制御された条件下でテストすることができます。膜トランスポーターは、すべてのタンパク質の8〜10を構成し、大部分は、モデル生物のいずれかで完全に特徴付けられていない。
オルガネラ膜に局在するトランスポーターは、真核細胞の異種発現によって特徴付けるのが特に困難です。交換タイプまたはプロトン媒介性トランスポーターがこの大腸菌膜に局在化できる場合、これらのトランスポーターは、このインビトロアッセイを使用して機能的に特徴づけることができる。小胞の質と収率は、フランスのプレスからの細胞断片の溶出速度によって影響を受ける。
同位体を用いた小胞の輸送アッセイを行う際には、実験複製を容易にする実験用セットアップを行うことが重要である。これを行う方法はたくさんありますが、私たちがどのようにやってきたかを示すのが役に立つと思います。
