IPは、カナダ自然科学・工学研究協議会（NSERC＃418233-2012）の資金提供を受けています。ケベック・サンテ（FRQS）、ケベック乳がん財団のキャリア賞、カナダ財団のイノベーション・グラントのリーダー・ファンド・グラントなどがあります。 EDはFondationの大学のArmand-Frappierから奨学金を受けました。

この研究で使用された全ての動物プロトコールは、University Animal Care Committee（INRS-Institut Armand-Frappier、Laval、Canada）によって承認された。 1.タンパク質共局在の同定<ol><li> 組織から顕微鏡スライドまで 注記：組織や切片はドライアイスで取り扱う必要があります。 <ol><li>動物から乳腺を摘出する（この手順の完全な説明については、Plante らを参照のこと） 14 。 </li><li>切除した組織をドライアイス上の凍結/マウント培地に包埋する。腺を覆うのに十分な培地を加える。培地が凝固したら、組織を冷凍庫に移し、後で使用するために-80℃で保存する。 </li><li>凍結ミクロトームを-35℃以下に設定して、組織を7-10μmの厚さの切片に切断し、顕微鏡スライド上に置く。 注：可能であれば、各スライドに2つのセクションを配置してください。左のセクションは抗体の特異性および組織の自己蛍光を確認するための通常の制御、右側は抗体で標識される。 </li><li>後で使用するためにセクションを-80°Cに保ちます。 </li></ol></li><li> Co-IF染色 <ol><li>冷凍庫から適切な顕微鏡スライドを回収し、室温（RT）でホルムアルデヒド4％中に15分間浸漬することにより、セクションを直ちに固定する。 </li><li>次に、スライドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に室温で浸します。次のステップに進むまで、RTでPBS中にスライドを放置する。 </li><li>市販の疎水性バリアーまたは撥水ラボペン（ 表の表を参照 ）を使用してスライドの各セクションを囲みます。組織に触れないように注意してください。直ちに、PBSの滴を組織に加え、手順の残りの間、湿った組織学的チャンバー内にスライドを置く。 注記：組織切片は湿ったままでなければなりません。オルタナティブ蓋が付いた箱を使用し、底に濡れた紙タオルを置きます。 </li><li> 3％ウシ血清アルブミン（BSA） - トリス緩衝生理食塩水（TBS）-0.1％ポリソルベート20（材料の表参照）の100-200μLで各組織切片をRTで30分間ブロックする。サンプルがブロッキングしている間に、抗体をTBS-0.1％ポリソルベート20で希釈することにより、一次および二次抗体溶液を調製する。 注：抗体に必要な濃度は製造業者によって提供される。実施例については、 表 1および2ならびにDianati et al。を参照のこと。 9 。ほとんどのフルオロフォア結合抗体を使用する場合、暗所で作業する必要はありませんが、抗体溶液や染色組織を強い光にさらさないようにしてください。 </li><li>吸引によってブロッキング溶液を除去し、希釈した一次抗体100〜200μL中の切片をRTで60分間インキュベートする。代替4℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートする。 </li><li>一次抗体溶液を吸引により除去し、切片をTBS-0.1％ポリソルベート20250-500μLで5分間洗浄する。吸引によって洗浄液を除去し、洗浄を2回繰り返す。 </li><li>洗浄液を吸引して除去し、切片を適切なフルオロフォア結合二次抗体100〜200μLと共に室温で60分間インキュベートする。 </li><li>二次抗体溶液を吸引除去し、TBS-0.1％ポリソルベート20250-500μLで切片を5分間洗浄する。洗浄溶液を除去し、2回繰り返す。 </li><li>目的の次のタンパク質に一次抗体と二次抗体の適切な組み合わせを使用して、ステップ2.5-2.8を繰り返します。 </li><li>洗浄液を吸引除去し、TBS-0.1％ポリソルベート20中の1mg / mLの4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を100-200μLで5分間インキュベートすることにより核染色を行う。RT。 </li><li>吸引によりDAPI溶液を除去し、水溶性で非蛍光性のマウント媒体（ 表の表を参照 ）およびカバーガラスを用いてスライドをマウントする。一度に1つのスライドを進めます。 注：核染色を5分間以上インキュベートしても、染色の強度は変わりません。あるいは、すべてのスライド上のDAPI溶液を除去し、スライドをマウントしながらPBSで組織をインキュベートする。 </li><li>少なくとも8時間4℃の冷蔵庫に平らにスライドを置きます。蛍光顕微鏡イメージングに進みます（ 図1と図2を参照）。 </li></ol></li><li> 顕微鏡イメージング <ol><li>特定の波長でフルオロフォアを励起するのに必要な様々なレーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用して、フルオロフォア結合二次抗体を視覚化する。 注：ダクトおよび肺胞を視覚化するためには、0.95の開口数を有する40倍の対物レンズが提案される。 explpleを図1に示します。 </li><li> 1つの波長で画像をスキャンすることにより、各タンパク質の局在を個々に確認する。 注：この段階では、接合タンパク質の局在を批判的に分析することが重要です。ジャンクショナルネクサスを形成することができるためには、これらのタンパク質は原形質膜に局在していなければならない。 </li><li>異なる波長でレーザーでスキャンされた画像をマージすることにより、タンパク質の共局在を決定する。 注：タンパク質共局在は、同じ場所で2つ以上のフルオロフォアが放出されることに起因する色の変化によって視覚化することができ、適切なソフトウェア（ 図1および図2 ;参考文献9も参照）を用いて測定することができる。 </li></ol></li></ol> 2. PPIの勉強注：腹部乳腺は、胸部腺が胸部と密接に関連しているため、PPIを研究するために使用する必要があります筋肉。 （この手順の完全な説明については、Plante et al 。を参照してください） 14乳腺を摘出し、後で使用するために-80℃に保ちます。 <ol><li> ライセートの調製 <ol><li>次のステップに進む前に、秤量紙と2 mLのマイクロ遠心チューブをドライアイスに置き、あらかじめ冷却してください。 </li><li> -80℃から乳腺組織を取り出し、ドライアイス上に保ちます。 </li><li>あらかじめ冷却した秤量紙上で組織の重量を測り、組織を2 mLのマイクロ遠心チューブ（ドライアイスで処理）に移す。サンプルあたり50〜100mgの組織を使用する。ステップ2.1.5まで組織をドライアイス上に保つ。 </li><li> NaF、NaVO 3 、およびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤を補充したトリプル界面活性剤溶解バッファーの必要量を、次の式を使用して表の表に示すように調製する 。マウス：必要な緩衝液（μL）=マウス組織重量（mg）×3;ラット：必須緩衝液（μL）=ラット組織重量（mg）×5。 </li><li>必要量の氷冷溶解緩衝液（ステップ2.1.4で計算）を組織を含む2mLチューブに加える。 注記：ステップ2.1.5-2.1.6では、一度に1本のチューブで作業を進めます。 </li><li>組織粉砕機で連続ホモジナイゼーションを用いて30〜40秒間組織をホモジナイズする;常にチューブを氷上に置いてください。組織ホモジナイザーを中速に調整し、グラインダーをチューブ内で静かに上下に動かします。 </li><li>他のチューブでステップ1.6と1.7を繰り返します。 </li><li>溶解物を氷上で10〜30分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で10分間170 xgでチューブを遠心分離する。 </li><li>一方、各サンプルについて6〜10個のマイクロ遠心チューブ（0.6 mL）を特定し、氷上に保ちます。 </li><li>遠心分離が完了したら、チューブを点検する。それらが、脂肪、透明、黄色〜ピンクの溶解物（発育段階に依存する）およびペレットの最上層を含有することを確認する。 </li><li>脂質層に穴を作る200μLのピペットチップを用いて液相にアクセスする。チップを交換し、ペレットを乱すことなく、または脂質層を吸引することなく溶解物を収集する。ライセートを氷上で予め標識したチューブに分注し（ステップ2.1.11）、-80℃で保存します。 </li><li>アリコートを使用して、適切な市販キット（ 表の表を参照 ）を使用してタンパク質濃度を定量する。 </li></ol></li><li> 間接免疫沈降 <ol><li>氷上で、前に調製した総乳腺溶解物の2つのアリコートを解凍する。 注：1つのアリコートは標的タンパク質のIPに使用され、もう1つはネガティブコントロールとして使用されます。 </li><li> 500-1,000μgのライセートを集め、PBSで希釈して各1.5 mLチューブで200μLの最終容量に達する。 注記：使用するライセートの量は、目的のタンパク質の存在量および抗体の効率に依存します（ 図3のanの例、および材料の表 ）。各標的に対して最適化するために、異なる量の溶解産物（ すなわち 、500,750、および1,000μg）および抗体（ すなわち 、5,10、および20μg）を使用すべきである。次の手順（2.2.3-2.3.7.4）を実行します。 </li><li>目的の抗原に対する抗体をライセートの最初のチューブに加え、氷上に保ちます。 注記：必要な金額は、通常、各社が提供する指示書に示されています（材料表を参照 ）。 </li><li> 2番目のチューブでは、2.2.3で使用した抗体と同じ濃度のアイソタイプIgGコントロールを加えてネガティブコントロールを調製します。 </li><li>チューブを4℃で一晩、チューブローラーミキサーで低速でインキュベートする。 </li><li>翌日、50μLの磁気ビーズを新たな1.5mLチューブに加えて予備洗浄します。 <ol><li>抗体に対する相対的親和性に基づいてプロテインAまたはプロテインG磁気ビーズを選択してください。 </li&gt; <li>凝集ビーズの使用を避けることが重要です。ビーズ懸濁液を均一に再懸濁させてチューブに加える前に、ビーズ懸濁液を静かに混合する。 </li></ol></li><li>ビーズを入れたチューブを磁気スタンドに置き、ビーズを磁石に移動させます。 200μLピペットを使用してビーズから保存バッファーを取り出します。 </li><li> 500μLのPBS-0.1％ポリソルベート20を加えてビーズを洗浄し、10秒間チューブを激しくボルテックスする。 </li><li>チューブを磁気スタンドに戻し、ビーズを磁石に移動させます。 </li><li>過剰の洗浄バッファーをピペットで200μLピペットで取り除きます。 </li><li>ステップ2.2.5の反応複合体（ライセート - 抗体）をビーズに加え、ローラーミキサーでRTで90分間インキュベートする。 </li><li>チューブを磁気スタンドに置き、ビーズを磁石に移動させます。 200μLピペットを使用して、ライセートを吸引して廃棄し、チューブを氷上に置きます。 </li><li>ビーズを洗う500μLのPBSを添加し、チューブを磁気スタンド上に置き、200μLのピペットを用いて液体を除去することによって調製した。この洗浄ステップを繰り返します。洗浄工程中はボルテックスを避け、サンプルを氷上に置いてください。 </li><li>ボルテックスせずにPBS-0.1％ポリソルベート20でビーズを1回洗浄し、200μLピペットチップを使用して最後の洗浄バッファーを捨てる。 </li><li>溶出するために、20μLの0.2M酸性グリシン（pH = 2.5）をチューブに加え、ローラーミキサーで7分間振盪する。 </li><li>数秒間高速で遠心分離し（急速回転）、上清を新鮮な氷冷したチューブに集める。 </li><li>各チューブについてステップ2.2.14と2.2.15を繰り返します。 注：最終容量は40μLになります。 </li><li>ステップ2.2.16の40μL溶出サンプルに10μLの4倍Laemmliバッファーを加えます。 注：酸性のpHのため、色は黄色に変わります。 </li><li>直ちに、ステップ2.2.18からの溶出したサンプルに1Mトリス（pH = 8）を一度に1滴ずつその色まで加える青色に変わります。次のチューブに進んでください。 </li><li>ステップ2.2.18のサンプルを70-90℃で10分間煮沸する。すぐにゲル電気泳動に進む。あるいは、サンプルを-80℃の冷凍庫に移してローディングする。 </li></ol></li><li> 下流適用：ゲル電気泳動、続いてウエスタンブロット <ol><li> SDS-PAGEアクリルアミドゲル（1.5 mm厚）を標準手順に従って分離して積み重ねる準備をする15 。 注：ゲルの選択（8-15％アクリルアミド、グラジエント：材料の表を参照 ）は、沈殿するタンパク質の分子サイズと解析される可能性のある結合パートナーの分子サイズに基づいて決定する必要があります。これらのタンパク質は、適切な免疫検出を可能にするために互いに解決されなければならない。 </li><li>氷上で免疫沈降（IP）溶出サンプル（ステップ2.2.20）を解凍する。 </li><li>同じサンプルからタンパク質溶解物を調製する（上記IP手順に使用）。 50を使用総溶解物μgを添加し、4X Laemmliサンプル緩衝液を添加する。試料を70〜90℃で5分間煮沸し、氷上に置く。 注：これらのサンプルは溶出されたIPサンプルの横にロードされ、全ライセート中の沈殿したタンパク質の存在を実証します。 </li><li>ステップ2.3.3から調製した溶解物およびステップ2.2.20からの沈殿したサンプルをアクリルアミドゲルに並べて入れ、ランニングバッファー（10xランニングバッファー：トリス30.3g、グリシン144.1g、および10 gのSDSを1Lの蒸留水に溶解したもの）を100Vで約95分間、または移動しているタンパク質の端部がゲルの底に達するまで攪拌する。 </li><li>標準プロトコール9,15を使用してニトロセルロースまたはPVDF膜にゲルを移す。 </li><li>膜を5％乾燥ミルク-TTBS（20mMトリス、500mM NaCl、および0.05％ポリソルベート20）中、低速でロッカー上で1時間ブロックする。 </li><li>降水量が成功したかどうかを確認する無邪気な。 <ol><li>沈降したタンパク質に対する第1抗体を用いて膜をプローブし、5％ドライミルク-TTBSで希釈し、製造元が推奨する濃度で4℃で一晩、ゆっくり撹拌しながらロッキングプラットフォーム上でプローブする。 注： 推奨事項については表の表を参照してください。 </li><li>翌日、高撹拌のロッキングプラットフォーム上でTTBSを用いてそれぞれ5分間3回膜を洗浄する。 </li><li> TTBSで希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）と結合した適切な二次抗体中の膜を、室温で1時間、ゆっくり攪拌しながらロッキングプラットフォーム上でインキュベートする。 注：あるいは、シグナルを検出するための適切な装置が利用可能であれば、蛍光色素と結合した二次抗体を使用することができます。 </li><li>高撹拌のロッキングプラットフォーム上でTTBSを用いてそれぞれ5分間3〜6回洗浄する。メンブレンを市販のa抗体とインキュベートすることによって二次抗体のシグナルを分析する。使用可能なルミノール溶液（材料の表を参照 ）を使用し、製造元の指示に従ってください。化学発光イメージングシステムを使用してシグナルを検出します（ 表の表を参照 ）。 注：ウェスタンブロット分析に関する詳細なプロトコールについては、参考文献16を参照してください。 </li></ol></li><li>相互作用するタンパク質を同定するために、同じブロット上の適切な抗体を用いて2.3.7.1〜2.3.7.4のステップを実行する。 注：タンパク質が相互作用している場合、結合パートナーは標的タンパク質と免疫共沈降し、ウェスタンブロッティングによって検出可能となります。タンパク質の分子量がゲルおよび膜上で十分に分離するのに十分に異なる限り、他のタンパク質が同じタンパク質複合体に存在するかどうかを決定するために、より多くの抗体を用いてステップ2.3.8を繰り返すことができる。 </li><li>同定された結合パートナーがアーチファクトではないことを確認するために、相反的IPを実施すべきである。 注：これは、ステップ2.2.1〜2.2.20を同じ溶解物で行うが、ステップ3.8で同定した結合パートナーの1つを沈殿させる。次いで、目的の第1のタンパク質に対する一次抗体を用いて、ステップ3.1〜3.8を繰り返す。 </li></ol></li></ol>

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著者は宣言することは何もない。

接合部を介する細胞間相互作用は、乳腺などの多くの器官の適切な機能および発達のために必要とされる。研究により、接合タンパク質は相互の機能および安定性を調節し、細胞膜10にお互いをつなぎ合わせることによってシグナル伝達を活性化することが示されている。現在の原稿で提示されたプロトコールは、正常なマウス腺の発生中のジャンクショナルタンパク質の?...

乳腺の成長と発達は、主に出生後に起こる。この臓器は、哺乳動物の生殖生涯を通して常にそれ自体を改造する1 。成体乳腺上皮は内腔上皮細胞の内層と基底細胞の外層（主に筋上皮細胞から構成され、基底膜2で囲まれている）からなる。乳腺の構造と発達に関する良いレビューのために、読者はSternlicht 1を参照することができます。腺1、3、4、5、6の正常な発達および機能のためには、ギャップ（GJ）、タイト（TJ）およびアフェレン（AJ）ジャンクションを介した細胞 - 細胞相互作用が必要である。マウス乳腺におけるこれらの接合部の主成分は、Cx26、Cx30、Cx32、およびCx43（GJ）である。 Claudin-1、-3、-4、-7およびZO-1（TJ）; E-カドヘリン、P-カドヘリンおよびβ-カテニン（AJ） 7,8 。これらの異なる接合タンパク質の発現レベルは、乳腺発達中に段階依存的に変化し、異なる細胞 - 細胞相互作用要件を示唆している9 。 GJ、TJ、およびAJは、構造的および機能的に連結され、隣接する細胞の隣接する部位に他の構造または調節タンパク質をつなぎ合わせることにより、接合的連結体10を生成する。結合接合の組成は、根底にある細胞骨格との架橋、ならびにネクサスの透過性および安定性に影響を及ぼし得、その結果、腺8,9,10,11の機能に影響を及ぼし得る。接合部接合部に存在するか、または相互に相互作用する細胞間接合部の成分は、乳がん発達の最近の発達段階を、共免疫蛍光（co-IF）および同時免疫沈降（co-IP） 9を用いて最近解析した。他の技術はタンパク質間の機能的関連性の評価を可能にするが、これらの方法はこの原稿には示されていない。 タンパク質は機能するだけで単独で作用するため、シグナル伝達や生化学カスケードなどのタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の研究は多くの研究者にとって不可欠であり、タンパク質の機能に関する重要な情報を提供することができます。 Co-IFおよび顕微鏡分析は、同じ細胞下の空間を共有するいくつかのタンパク質を評価するのに役立ちます。しかしながら、標的の数は、異なる動物において惹起されなければならない抗体によって、および異なる波長レーザーを備える共焦点顕微鏡および多重化のためのスペクトル検出器にアクセスすることによって制限される。 Co-IPは、親和性の高い物理的相互作用を確認または明らかにするタンパク質複合体内に存在する2つ以上のタンパク質を含む。タンパク質の局在化および相互作用を同時に検出することができる蛍光共鳴エネルギー移動（FRET） 12および近接ライゲーションアッセイ（PLA） 13などの新規技術の開発にもかかわらず、co-IPは、間の相互作用を研究するための適切かつ手頃な技術である内在性タンパク質。 この原稿で説明されている段階的方法は、乳腺の内在性PPIを研究する際に避けるために、タンパク質の局在化およびPPIの研究を容易にし、落とし穴を指摘するでしょう。この方法論は、各技術に必要な組織の異なる保存手順の提示から始まる。第1部では、i）乳腺の切片化、ii）co-IF法を用いた異なるタンパク質の二重標識または三重標識、およびiii）タンパク質の局在化。パート2は、内因性タンパク質を沈降させ、その相互作用タンパク質をi）溶解産物調製、ii）間接タンパク質免疫沈降、およびiii）SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによる結合パートナー同定の3つのステップで同定する方法を示す。このプロトコールの各ステップは、げっ歯類の乳腺組織に対して最適化され、高品質で特異的かつ再現性のある結果を生じる。このプロトコールは、他の組織または細胞系におけるPPI研究の出発点として使用することもできる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice strain and stage&#160;</td>
			<td>St. Constant, Quebec, Canada</td>
			<td></td>
			<td>C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4&#8226;7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water.&#160; 
			2)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Adjust the PH to 7.4&#160; 
			3)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Add water to reach to the 1 litre final volume.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS 10X (stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water.&#160; 
			2)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Adjust the PH to 7.5&#160; 
			3)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Add water to reach to the 1 litre final volume.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 1-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing media</td>
			<td>VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada</td>
			<td>95067-840</td>
			<td>VMR frozen sections compound&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>956640</td>
			<td>Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>C.L. Sturkey, Inc. Les Produits&#160;Scientifiques&#160;ESBE&#160;St-Laurent, QC, Canada</td>
			<td>&#160;BLM1001C</td>
			<td>High profile gold coated blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td>Cedarlane, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>8899</td>
			<td>Super PAP Pen, Thermo fisher scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>FOR201.1</td>
			<td>Forlmadehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Oakville, ON, Canada</td>
			<td>P 9416</td>
			<td>Tween 20, Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Cedarlane, Burlington, ON</td>
			<td>17984-25(EM)</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada&#160;</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>&#946;-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>Connexin26&#160; (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei stain</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software of IF images analysis</td>
			<td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td>
			<td></td>
			<td>NIS-elements software (version 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 2-Immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1) Mix 50mM TRIS (F.W.&#160;:121.14), 150mM NaCl (F.W.&#160;:58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O.&#160; 
			2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 
			3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge.&#160; 
			At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: 
			Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/phosphatase inhibitor</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>78441</td>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein dosage</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td>Pierce BCA protein assay kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>FTH-115</td>
			<td>Power 125, Model FTH-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads and stand</td>
			<td>Millipore, Etobicoke, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution for IP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 &#181;l/200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada</td>
			<td>1610747</td>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Add &#946;-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>PB381-5</td>
			<td>0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 M (pH=8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE acrylamide gels&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1610180 -5</td>
			<td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer 10x&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704272</td>
			<td>Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membranes</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704272</td>
			<td>PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer method</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704155</td>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Milk</td>
			<td>Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution for blots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing solutions for blots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody&#160; (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366)&#160; 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Claudin3&#160; (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody&#160; (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution for signal detection on blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1705061&#160;</td>
			<td>Clarity Western ECL Blotting Substrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1708280</td>
			<td>ChemiDoc MP imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analayzing blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>ImageLab 5.2 software&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein-protein interactions and co-localization between components of gap, tight, and adherens junctions in murine mammary glands

細胞 - 細胞相互作用は、組織の完全性および乳腺の異なる区画間の障壁を保存する中枢的役割を果たす。これらの相互作用は、隣接する細胞間の連結を形成する結合タンパク質によって提供される。接合タンパク質の位置の誤った局在化およびそれらの結合パートナーとの物理的関連の低下は、機能の喪失をもたらし、その結果、器官の機能不全をもたらし得る。したがって、正常および疾患関連組織におけるタンパク質局在化およびタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の同定は、発症状態の疾患または変化の進行につながる新しい証拠およびメカニズムを見出すために不可欠である。この原稿は、マウス乳腺におけるPPIを評価するための2段階の方法を提示している。プロトコルセクション1では、目的のタンパク質に対して生じた抗体、続いて蛍光色素で標識された二次抗体を用いて共免疫蛍光（co-IF）を行う方法が記載されている。 co-IF allタンパク質の接近を実証するために、物理的な相互作用を研究することが可能です。したがって、共免疫沈降（co-IP）のための詳細なプロトコールがプロトコールセクション2に提供される。この方法は、これらの相互作用が直接的であるか間接的であるかを確認することなく、タンパク質間の物理的相互作用を決定するために使用される。ここ数年、co-IFおよびco-IP技術は、細胞間接合のある種の成分が共に局在化し、相互作用し、乳腺発達中に変化する段階依存的接合結合を生じることを実証している。

GJ、AJ、およびTJ成分が乳腺で相互作用できるかどうかを判定するために、最初にco-IFアッセイを行った。 GJタンパク質であるCJ26とAJタンパク質であるβ-カテニンを特異的抗体でプローブし、それぞれフルオロフォア接合マウス647（緑色、疑似色）およびヤギ568（赤色）抗体を用いて明らかにした（ 図1BおよびC ） 。データは、泌乳日7日目（L7...

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Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

細胞間接合部は、乳腺段階特異的機能および発達のための必要条件である。この写本は、タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の研究およびマウス乳腺を用いた共局在のための詳細なプロトコールを提供する。これらの技術は、異なる発達段階での細胞間接合間の物理的関連の動態の調査を可能にする。

マウス乳腺のギャップ、タイトおよびアデュランス接合部の成分間のタンパク質 - タンパク質相互作用および共局在の分析

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

analysis-protein-protein-interactions-co-localization-between

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K ビュー.  INRS, Institut Armand-Frappier. 細胞間接合部は、乳腺段階特異的機能および発達のための必要条件である。この写本は、タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の研究およびマウス乳腺を用いた共局在のための詳細なプロトコールを提供する。これらの技術は、異なる発達段階での細胞間接合間の物理的関連の動態の調査を可能にする。 

ビデオ: Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

発生生物学

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

細胞系譜マーカーの共局在とトマト信号

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC)-derived extracellular vesicles can be isolated from NAMEC medium via differential ultracentrifugation. Based on their density, EVs can be purified via ultracentrifugation at 110,000 x g. The EV preparation from ultracentrifugation can be further separated using a continuous density gradient to prevent contamination with soluble proteins. The purified EVs can then be further evaluated using nanoparticle-tracking analysis, which measures the size and number of vesicles in the preparation. The extracellular vesicles with a size ranging from 50 to 150 nm are exosomes. The NAMEC-derived EVs/exosomes can be ingested by mammary epithelial cells, which can be measured by flow cytometry and confocal microscopy. Some mammary stem cell properties (e.g., mammary gland-forming ability) can be transferred from the stem-like NAMECs to mammary epithelial cells via the NAMEC-derived EVs/exosomes. Isolated primary EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells cannot form mammary glands after being transplanted into mouse fat pads, while EpCAMlo/CD49fhi basal mammary epithelial cells form mammary glands after transplantation. Uptake of NAMEC-derived EVs/exosomes by EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells allows them to generate mammary glands after being transplanted into fat pads. The EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells transfer mammary gland-forming ability to EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells.

This protocol describes methods for purifying, quantitating, and characterizing extracellular vesicles (EVs)/exosomes from non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cells and for using them to transfer mammary gland-forming ability to luminal mammary epithelial cells. EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells can transfer this cell property to cells that ingest the EVs/exosomes.

細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of vasculogenesis has become a central readout of endothelial progenitor cell functionality, and therefore, several attempts have been made to improve both in vitro and in vivo vasculogenesis models. However, standard methods are limited in scope, with static measurements failing to capture many aspects of this highly dynamic process. Therefore, the goal of developing this novel protocol was to assess the kinetics of in vitro vasculogenesis in order to quantitate rates of network formation and stabilization, as well as provide insight into potential mechanisms underlying vascular dysfunction. Application of this protocol is demonstrated using fetal endothelial colony forming cells (ECFCs) exposed to maternal diabetes mellitus. Fetal ECFCs were derived from umbilical cord blood following birth, cultured, and plated in slides containing basement membrane matrix, where they underwent vasculogenesis. Images of the entire slide wells were acquired using time-lapse phase contrast microscopy over 15 hours. Images were analyzed for derivation of quantitative data using an analysis software called Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV). KAV uses image segmentation followed by skeletonization to analyze network components from stacks of multi-time point phase contrast images to derive ten parameters (9 measured, 1 calculated) of network structure including: closed networks, network areas, nodes, branches, total branch length, average branch length, triple-branched nodes, quad-branched nodes, network structures, and the branch to node ratio. Application of this protocol identified altered rates of vasculogenesis in ECFCs obtained from pregnancies complicated by diabetes mellitus. However, this technique has broad implications beyond the scope reported here. Implementation of this approach will enhance mechanistic assessment and improve functional readouts of vasculogenesis and other biologically important branching processes in numerous cell types or disease states.

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Here, we present a protocol for time-lapse imaging and analysis of vasculogenesis in vitro using phase contrast microscopy coupled with the open source software, Kinetic Analysis of Vasculogenesis. This protocol can be applied to quantitatively assess the vasculogenic potential of numerous cell types or experimental conditions that model vascular disease.