このプロトコルは、平滑筋細胞および受動母質からの寄与を解明する生殖器官の二軸的な機械的特性を調べる。この技術は、器官の形状および母体の平滑筋細胞をマトリックス相互作用に維持し、器官の主観的な圧力および軸エクステンションの範囲に器官を受ける。生理学的に関連する負荷下での臓器二軸機能を調べていると、生殖病理の病因をよりよく理解する助けとなるかもしれない。
子宮頸部と膣を隔軸的に検査すると、女性の健康とバイオメカニクスの分野に関する洞察が得られます。同様の方法は、血管、食道および大腸を研究するために利用される。新しい臓器を使用する場合、組織を縫合する方法やアンロードされた長さを決定する方法などの技術的な詳細を確定するのに時間がかかる場合があります。
実験動物から生殖器系を採取するには、マウスを解剖顕微鏡の下の吸収パッドの上に置き、斜めピンセットとハサミを使って腹部の周りの皮膚を持ち上げます。腹筋壁を穿刺しないほど浅い恥骨の上の腹部の基部に最初の切開を行い、肋骨ケージに向かって優れた切開を続け、腹筋を通して深く切開を続ける。表面的な脂肪を取り除き、慎重に陰部のシンフィシスを切断した後、まっすぐなピンセットを使用して膀胱をつかんで緊張を作り出し、鈍い解剖を使用して周囲の組織を膣から分離する。
その後、生殖器系の基盤を切断して、体腔から組織を取り除く。収穫されたシステムに適したサイズのカニューレを決定した後、頸部側をカニューレーション装置の力のトランスデューサ部分に取付け、装置のマイクロメータ部分にオルガンの反対側端を取り付ける。その後、縫合糸で両端を締めます。
装着された組織のアンロードされた長さを見つけるには、まず壁が張力を持たないように臓器を伸ばします。膣の場合は、膣壁の溝を観察します。子宮頸部の場合は、中央の子宮頸部の上と下にあるインクドットのすぐ下に切ります。
キャリパーを使用して、縫合糸から縫合までのシステムの長さを測定し、1ミリメートルの水銀増分で、ミオグラフシステムの圧力を0から10ミリメートルの水銀に上げます。臓器が崩壊しなくなった圧力は、所定の圧力で外径で最大のジャンプとして決定することができます。圧力と外径を記録した後、これらのデータを臓器が崩壊しない最初の点として注意し、力をゼロにする。
インビボストレッチの実験を見つけるには、アンロードされた圧力で推定インビボの長さにオルガンを調整し、開始をクリックして、アンロードされた圧力から最大圧力までの圧力値の圧力対力値を評価します。次に、[停止] をクリックしてファイルを保存します。圧力直径プリコンディショニングの場合は、圧力を水銀の0ミリメートル、実験のインビボの長さに、勾配を1秒あたり1.5ミリメートルに設定します。
水銀のゼロミリメートルから最大圧力とアンロードされた圧力までの圧力を取り、30秒間保持し、さらに30秒のホールド期間で水銀のゼロミリメートルに戻るシーケンスを実行します。このシーケンスを合計 5 サイクル繰り返した後、[停止] をクリックしてファイルを保存します。力長プリコンディショニングの場合は、最大圧力の1/3と入口圧と出口圧力の両方に対するアンロードされた圧力を入力し、インビボの長さのマイナス2%にオルガンを調整します。
開始をクリックし、長さを2%in vivoの長さに調整し、10マイクロメートル/秒のレートでマイナス2%まで戻ります。[停止]をクリックしてファイルを保存する前に、合計 5 サイクルの軸方向の延長を繰り返します。インビボの長さの圧力直径のテストのために開始をクリックし、インビボの長さに臓器を調整し、水銀の0ミリメートルに圧力を設定し、1秒あたり水銀の1.5ミリメートルに勾配を設定します。
20秒のホールド期間で圧力をゼロミリメートルの水銀に戻す前に、水銀のゼロミリメートルから最大圧力まで圧力を上げます。その後、システムを停止してデータを保存する前に、5 サイクルのテストを繰り返します。最大圧力の1/3とアンロードされた圧力の力長テストでは、圧力を最大圧力とアンロードされた圧力の1/3に設定し、インビボの長さのマイナス2%にオルガンを調整します。
開始をクリックした後、インビボの長さのプラス2%に臓器を伸ばし、毎秒10マイクロメートルの速度でインビボの長さのマイナス2%に戻ります。次に、システムを停止してデータを保存する前に、合計 3 サイクルのテストを繰り返します。最後の試験の後、KRB試験培地を取り出し、カルシウムを含まないKRB培地で臓器を洗浄します。
洗浄後、2ミリモルEGTAを補った新鮮なカルシウムフリーKRB溶液で臓器を30分間インキュベートし、処理液を新鮮なカルシウムフリーKRBに置き換えます。基底調試験の完了時に、圧力直径の事前調整のために、開始をクリックし、圧力を水銀の0ミリメートル、推定インビボ長さとしての長さ、および1.5ミリメートルの水銀/秒に勾配に設定します。水銀のゼロミリメートルから最大圧力に圧力を取り、水銀の0ミリメートルに戻るシーケンスを実行し始めます。
このプロセスを 5 サイクル繰り返し、30 秒のホールドタイムを設定します。力の長さの予備調整のために、インビボの長さにオルガンを調節し、手動で両方の圧力のためのアンロードされた圧力を入力する。[開始]をクリックし、勾配を水銀の1.5ミリメートル、圧力を最大の1/3に設定します。
オルガンをプラス2%まで伸ばし、毎秒10マイクロメートルでマイナス2%のストレッチまで戻り、合計5回サイクルを繰り返します。圧力直径試験では、実験で決定されたインビボ長さのマイナス2%の臓器と水銀の0ミリメートルの圧力で、開始をクリックして水銀のゼロミリメートルから最大圧力まで圧力を上げ、水銀の0ミリメートルに戻ります。水銀のステップのゼロミリメートルを20秒間保持し、サイクルを5回繰り返します。
力の長さのテストのために、わずかな圧力に圧力を設定し、インビボの長さのマイナス2%にオルガンを調整します。インビボ長さのプラス2%までオルガンを伸ばし、10マイクロメートル/秒の速度でインビボ長さのマイナス2%に戻します。合計3サイクル後、データを保存し、最大圧力の1/3、最大圧力の2/3、および最大圧力で力長テストを繰り返します。
女性の生殖器官の機械的特性の解析を成功させるためには、欠陥を伴わずに膣に子宮の角を出す必要があります。臓器の種類によって、カニューレの大きさは異なります。試験中に臓器が動かないように、そして、処置の間に器官の壁を傷つけることなく、cannulationを行わなければならない。
圧力ミオグラフシステムは、機械的検査を受ける臓器の様々な側面を監視するために使用することができ、超音波システムは、基底音の有無にかかわらず、アンロード状態の臓器の厚さを測定するために使用することができます。機械的試験の後、接線弾性率は、周方向および軸方向について計算され得る。基礎音調試験と受動的検査の両方が、平滑筋細胞の収縮寄与の有無にかかわらず生殖管の主要な機械的特性をもたらす。
子宮頸部と膣が生体内で異なる負荷を経験するので、器官間のスケーリングはプロトコルにいくつかの調整を必要とする。平滑筋細胞の生存率を維持するために迅速に解剖を行うことが重要ですが、所望の器官を穿刺しないように注意してください。臓器の残存歪みを測定する開口角度実験は、機械的検査手順の後、ならびに様々な組織学的および生化学的アッセイの後に行うことができる。
平滑筋細胞の基底寄与の開発および調査の後、この技術はまた、生理学的に関連する負荷の下で生殖器系の平滑筋最大収縮反応を評価することを可能にする。
