Tono basale biassiale e test passivi del sistema riproduttivo Murine utilizzando un miografo a pressione

Questo protocollo indaga le proprietà meccaniche biassiali degli organi riproduttivi che spiegano il contributo delle cellule muscolari lisce e della matrice passiva. Questa tecnica mantiene la geometria dell'organo e le interazioni native del muscolo liscio con le interazioni matriciali permettendo la sottosezione dell'organo a una gamma fisiologica di pressioni ed estensioni assiali. Lo studio della funzione biassiale dell'organo sotto carichi fisiologicamente rilevanti può aiutare a comprendere meglio l'eziologia delle patologie riproduttive.

Testare biassialmente la cervice e la vagina fornisce informazioni sui campi della salute e della biomeccanica delle donne. Metodi simili vengono utilizzati per studiare i vasi sanguigni, l'esofago e l'intestino crasso. Quando si lavora con un nuovo organo, potrebbe essere necessario del tempo per finalizzare i dettagli tecnici come come suturare al meglio il tessuto o come determinare la lunghezza scaricata.

Per raccogliere il sistema riproduttivo dall'animale sperimentale, posizionare il mouse su un cuscinetto assorbente sotto un microscopio sezionante e utilizzare pinzette angolate e forbici per sollevare la pelle intorno all'addome. Fai un'incisione iniziale alla base dell'addome sopra l'osso pubico abbastanza bassa da non forare la parete muscolare addominale e continuare l'incisione in modo superiore verso la gabbia toracica e in profondità attraverso i muscoli addominali. Dopo aver rimosso il grasso superficiale e tagliato attentamente la sinfisi pubica, utilizzare una pinzetta dritta per afferrare la vescica per creare tensione e utilizzare la dissezione smussata per separare il tessuto circostante dalla vagina.

Quindi tagliare la base del sistema riproduttivo per rimuovere i tessuti dalla cavità corporea. Dopo aver determinato la cannula di dimensioni appropriate per il sistema raccolto, montare il lato cervicale sulla porzione del trasduttore di forza del dispositivo di cannula e montare l'estremità opposta dell'organo sulla porzione di micrometro del dispositivo. Quindi stringere entrambe le estremità con suture.

Per trovare la lunghezza scaricata del tessuto montato, allungare prima l'organo in modo che la parete non sia in tensione. Per la vagina, osservare le scanalature sulla parete vaginale. Per la cervice, tagliare immediatamente sotto i punti d'inchiostro situati sopra e sotto il segno centrale della cervice.

Utilizzare pinze per misurare la lunghezza del sistema dalla sutura alla sutura e aumentare la pressione del sistema del miografo da zero a 10 millimetri di mercurio in un millimetro di incrementi di mercurio. La pressione in cui l'organo non è più collassato può essere determinata come il salto più grande nel diametro esterno ad una data pressione. Dopo aver registrato la pressione e il diametro esterno, notare questi dati come il primo punto in cui l'organo non viene collassato e azzerare la forza.

Per trovare l'allungamento sperimentale in vivo, regolare l'organo alla lunghezza in vivo stimata mentre si è alla pressione scaricata e fare clic sull'inizio per valutare i valori di pressione rispetto alla forza per i valori di pressione che vanno dalla pressione scaricata alla pressione massima. Quindi fare clic su Interrompi e salva il file. Per il precondi condizionamento del diametro della pressione, impostare la pressione a zero millimetri di mercurio, la lunghezza alla lunghezza sperimentale in vivo e il gradiente a 1,5 millimetri di mercurio al secondo.

Eseguire una sequenza che porta la pressione da zero millimetri di mercurio alla pressione massima più la pressione scaricata, trattenere per 30 secondi e tornare a zero millimetri di mercurio con un ulteriore periodo di attesa di 30 secondi. Dopo aver ripetuto questa sequenza per un totale di cinque cicli, fare clic su interrompi e salva il file. Per il precondicondizione della lunghezza della forza, inserire 1/3 della pressione massima più la pressione scaricata sia per le pressioni di ingresso che di uscita e regolare l'organo a meno 2% della lunghezza in vivo.

Fare clic sul pulsante start e regolare la lunghezza su più 2% di lunghezza in vivo e tornare a meno 2% a una velocità di 10 micrometri al secondo. Ripetere l'estensione assiale per un totale di cinque cicli prima di fare clic su Interrompi e salva il file. Per il test del diametro della pressione della lunghezza in vivo, fare clic sull'inizio e regolare l'organo sulla lunghezza in vivo, impostare la pressione su zero millimetri di mercurio e impostare il gradiente su 1,5 millimetri di mercurio al secondo.

Aumentare la pressione da zero millimetri di mercurio alla pressione massima prima di riportare la pressione a zero millimetri di mercurio con un periodo di attesa di 20 secondi. Quindi ripetere il test per cinque cicli prima di arrestare il sistema e salvare i dati. Per la prova della lunghezza della forza di 1/3 della pressione massima più la pressione scaricata, impostare la pressione su 1/3 della pressione massima più la pressione scaricata e regolare l'organo a meno 2% della lunghezza in vivo.

Dopo aver fatto clic sull'inizio, allungare l'organo a più il 2% della lunghezza in vivo e tornare a meno 2% della lunghezza in vivo a una velocità di 10 micrometri al secondo. Quindi ripetere il test per un totale di tre cicli prima di arrestare il sistema e salvare i dati. Dopo l'ultimo test, rimuovere il mezzo di prova KRB e lavare l'organo con mezzo KRB privo di calcio.

Dopo il lavaggio, incubare l'organo con una fresca soluzione KRB priva di calcio integrata con eGTA millimolare per 30 minuti prima di sostituire la soluzione di trattamento con KRB fresco privo di calcio. Al termine del test del tono basale, per il precondi condizionamento del diametro della pressione, fare clic sull'inizio e impostare la pressione a zero millimetri di mercurio, la lunghezza come lunghezza stimata in vivo e il gradiente a 1,5 millimetri di mercurio al secondo. Inizia a eseguire una sequenza che porta la pressione da zero millimetri di mercurio alla pressione massima e torna a zero millimetri di mercurio.

Ripetere questo processo attraverso cinque cicli con un tempo di attesa di 30 secondi. Per il precondizione della lunghezza della forza, regolare l'organo alla lunghezza in vivo ed entrare manualmente nella pressione scaricata per entrambe le pressioni. Fare clic sull'inizio e impostare la sfumatura su 1,5 millimetri di mercurio e la pressione su 1/3 del massimo.

Allungare l'organo fino a più 2% e tornare a meno 2% di allungamento a 10 micrometri al secondo e ripetere il ciclo per un totale di cinque volte. Per il test del diametro della pressione, con l'organo a meno 2% della lunghezza in vivo determinata sperimentalmente e la pressione a zero millimetri di mercurio, fare clic sull'inizio e aumentare la pressione da zero millimetri di mercurio alla pressione massima e tornare a zero millimetri di mercurio. Tenere gli zero millimetri di passo del mercurio per 20 secondi e ripetere il ciclo cinque volte.

Per il test della lunghezza della forza, impostare la pressione su una pressione nominale e regolare l'organo a meno 2% della lunghezza in vivo. Allungare l'organo fino a più 2% della lunghezza in vivo e tornare a meno 2% della lunghezza in vivo ad una velocità di 10 micrometri al secondo. Dopo un totale di tre cicli, salvare i dati e ripetere il test della lunghezza della forza per 1/3 della pressione massima, 2/3 della pressione massima e alla pressione massima.

Per un'analisi di successo delle proprietà meccaniche degli organi riproduttivi femminili, è imperativo esplantare le corna uterine nella vagina senza difetti. A seconda del tipo di organo, la dimensione della cannula varierà. La cannulazione deve essere eseguita in modo che l'organo non possa muoversi durante l'esperimento ma senza danneggiare la parete dell'organo durante la procedura.

Il sistema di miografia a pressione può essere utilizzato per monitorare vari aspetti dell'organo mentre viene sottoposto a test meccanici e il sistema ad ultrasuoni può essere utilizzato per misurare lo spessore degli organi nello stato scaricato con e senza tono basale. Dopo le prove meccaniche, i moduli tangenti possono essere calcolati per le direzioni circonferenziale e assiale. Sia il test del tono basale che il test passivo producono proprietà meccaniche chiave del tratto riproduttivo con e senza il contributo contrattile delle cellule muscolari lisce.

Il ridimensionamento tra gli organi richiede alcune regolazioni dei protocolli poiché la cervice e la vagina sperimentano carichi diversi in vivo. È fondamentale eseguire rapidamente la dissezione per mantenere la vitalità delle cellule muscolari lisce ma con attenzione per non forare l'organo desiderato. Gli esperimenti ad angolo di apertura che misurano il ceppo residuo dell'organo possono essere eseguiti dopo procedure di prova meccaniche e vari saggi istologici e biochimici.

Dopo il suo sviluppo e l'indagine del contributo basale delle cellule muscolari lisce, questa tecnica consente anche di valutare la massima risposta contrattile muscolare liscia del sistema riproduttivo sotto carichi fisiologicamente rilevanti.