このプロトコルは、ヒト腸器官における脂質滴形成を定量化するいくつかの方法を説明する。これは、脂質滴形成を調節する薬物をテストするためのハイスループットスクリーニングプラットフォームとして使用することができます。我々が記述する方法は、脂質滴特異的な色素と生検由来の腸オルガノイドに基づいています。
これにより、脂質液滴形成のための安定した、正確な、生理学的に関連するモデルを提供する。このプロトコルは、例えばDGAT1欠損患者において脂質滴形成を調節する患者特異的新規薬剤候補をスクリーニングするために使用することができる。この脂質滴形成アッセイは、他の細胞型における脂質代謝を研究するために他のタイプのオルガノイド培養物にも適用することができる。
アッセイは、オルガノイド培養の密度に大きく依存する。サンプルと実験で一貫したオルガノイド密度を確保するようにしてください。このアッセイの視覚的なデモンストレーションは、オルガノイドがどのように培養されるべきか、そして脂質滴形成の適切な分析を確実にするためにどのように処理されるべきかを示することが重要であるため、非常に重要です。
オルガノイドを調製した後、基体膜マトリックスの液滴を乱すことなく培養培地を慎重に吸引する。オルガノイドの最初の井戸に冷たい基底培地の500マイクロリットルを追加します。P1000ピペットを使用して、ピペットを上下に穏やかにして、オルガノイドを含む基質膜マトリックス液滴を破壊する。
必要とされる次の同じ培地でこの手順を繰り返しますが、基礎培地の500マイクロリットルあたり2つ以上の井戸を収穫しないでください。低結合1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにオルガノイドを収集し、15〜20秒間ミニ卓上遠心分離機でそれらを回転させます。400マイクロリットルのトリプシンをスパンダウンオルガノイドに加えます。
摂氏37度の水浴で5分間インキュベートします。次に、P200ピペットを使用して、細胞の残りの凝集体を破壊するために、懸濁液を上下に穏やかにピペットします。摂氏37度の水浴で5分間インキュベートします。
単一の細胞だけが残っている場合は、基底培地の1ミリリットルを追加し、15〜20秒間ミニ卓上遠心分離機の細胞を回転させます。上清を完全に吸引する。P200ピペットを使用して、新鮮なhSI-EMの200マイクロリットルで単一の細胞を再中断し、さらに800マイクロリットルのhSI-EMを追加します。
次に、懸濁液のセル数を数え、最終的な細胞密度に必要な細胞の量を計算します。適切な懸濁液の量を取り出し、1マイクロリットル当たり750セルに密度を調整します。2対1の比率で細胞懸濁液に基部膜マトリックスを追加します。
気泡を作らないように注意して混ぜ合わせるようにサスペンションを軽くピペット。事前に温めた培養プレートで、プレートに96の井戸がある場合は、プレートに24の井戸または1ウェルあたり1つの5マイクロリットルの液滴がある場合は、ウェルあたり3つの10マイクロリットルの液滴をシードアウトします。プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れ、5%の二酸化炭素を10~15分間置き、液滴を固めます。
一方、摂氏37度の水浴で適切な量のhSI-EM+Yを事前に温めます。この後、慎重にプレートの各ウェルに事前に温めたhSI-EM + Yを追加します。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。
2~3日後、培地をhSI-EMに交換し、週に2~3回リフレッシュしてください。まず、室温で0.2グラムの液体オレイン酸を量る。培養グレードの無菌PBSを1.5ミリリットル加え、断続的に渦を出すことを確認するために1時間摂氏70度に混合物を加熱します。
次に、5.89グラムの脂肪酸を含まないBSAを秤量し、33.9ミリリットルのPBSに溶解する。BSAが完全に溶解するまで摂氏37度で水浴で混合物を温めます。オレイン酸混合物を再び渦液にして、微細な液滴のエマルジョンを作成し、すぐにガラスピペットを使用してBSA溶液に添加する。
透明な黄色がかった溶液が残るまで30分間、37°Cで混合物を保ちます。先に説明したようにオルガノイドを通過し、オルガノイド由来の単一細胞を黒いクリアボトム96ウェルプレートに播種する。hSI-EMで培養した6日目に、オレイン酸およびBSAコンジュゲートの1ミリモルを含むhSI-EMで培養培地を交換する。
0.1マイクロモルDGAT1阻害剤の有無に37°Cで16〜17時間培養します。この後、基質膜マトリックス液滴を乱さずに培地を吸引する。オルガノイドを4%中性緩衝ホルムアルデヒドの100マイクロリットルを室温で30分間ウェルに加えて固定する。
ホルムアルデヒドを優しく取り出し、150マイクロリットルのPBSで慎重に洗浄します。暗闇の中で室温で15分間PBSで025ミリグラム/ミリリットルLD540とDAPIで脂質滴の細胞を染色します。その後、PBSで井戸を慎重に洗います。
オルガノイド全体の概要画像には、共焦点蛍光イメージングに適した40倍の主観を使用します。ここに示す励起および放出設定を使用して、DAPIおよびLD540色素の画像に顕微鏡を設定します。十分な Z 軸の解像度を確保するために、ピンホールのサイズを 1 つの風通しの良い単位に設定します。
球状オルガノイドの半分を画像化するには、Zスタックを約85マイクロメートルに設定します。適切な画像処理システムを使用して、画像、スタック、Z プロジェクトをクリックして、各オルガノイドの Z スタックを最大投影に変換します。最大投影のしきい値を、BSA 車両制御サンプルに LD540 信号が表示されないレベルに設定するには、[画像]、[調整]、[しきい値] の順にクリックします。
これらの設定を使用して、各イメージをしきい値にします。次に、解析、粒子分析関数を使用して、各最大投影の蛍光の総面積を測定します。脂質滴形成の適切な分析のために、オレイン酸とそれに続く染色で刺激する前に、オルガノイドをあまり緻密に播種してはならない。
これは、重複するオルガノイドが蛍光を妨げる可能性があるため、共焦点およびプレートリーダーの読み出しにとって特に重要です。オレイン酸の1ミリモルで一晩刺激した後、脂質滴形成は、反転した明視野顕微鏡で可視化することができる。脂質滴の蓄積は透過光を散乱させ、したがってオルガノイドは暗く見えるのに対し、非刺激オルガノイドは半透明の外観を有する。
オレイン酸刺激オルガノイドが固定され、染色されると、脂質滴形成は共焦点顕微鏡を用いて可視化することができる。オルガノイドは3D構造であるため、通常の蛍光顕微鏡は焦点外のバックグラウンド信号のために適さないため、共焦点zスタックを使用してオルガノイドのLDFを特徴付けます。共焦点顕微鏡サンプルの定量化は、蛍光性Hoechst信号に正規化された蛍光プレートリーダーを用いて行うこともできます。
プレートリーダーアッセイは、未処理のオルガノイドと比較してDGAT1阻害剤で処理されたオルガノイド細胞におけるLD540シグナルの有意な減少を示す。個々の細胞におけるLD形成の定量は、フローサイトメーターを用いて達成することができる。ここに示す格言戦略は、解体ヒト腸オルガノイドの解体に対する戦略である。
最終生細胞集団のSSC-AおよびLD540シグナルの代表ヒストグラムは、細胞内脂質滴の形成により脂質滴形成がSSC-Aの増加をもたらすことを示している。また、脂質液滴に保存されている脂質に対するLD540染色、脂質液滴形成の誘導によりシグナルも増加します。したがって、脂質滴形成は、SSC−AおよびLD540の平均蛍光強度のシフトとして測定される。
このプロトコルの最も重要なステップは、ヒト腸器官の培養とBSAへのオレイン酸の適切な波形化である。より多くの条件に対応するために、このアッセイは蛍光プレートリーダーを用いて分析することができる。ウェル当たりのオルガノイド数を補正するために、LD540シグナルをDAPI信号に正規化した。
この技術により、研究者はオルガノイド系における脂質滴形成を研究し、電子顕微鏡などの様々な分析技術を改善してその発見を検証することができます。
