腸のバリア完全性を調べたいのち、小腸小器官のマウスにおける腸バリアの完全性を測定する手法を開発しました。これに対し、我々は使用した単層細胞培養を指し、我々のアッセイは3次元の小腸オルガノイドに基づいている。2次元アッセイをモデルに適応させることは、その実用性にとって不可欠でした。
このアッセイは、インビトロで培養されたオルガノイドに基づいており、その適用は腸バリア完全性の誘導物質および阻害剤を定義するのに役立ちます。密接タンパク質の調節は、すべての上皮細胞の重要な特徴です。当社のアッセイは、上皮バリア完全性の機能と解析を可能にします。
マウスの腸組織から分離されたオルガノイドのバリア完全性を測定するために、まず、プラスチック表面のすべてをカバーするのに十分な0.1%BSAでメッキプロセス中にオルガノイドを保存するために使用される遠心チューブのすべてをプレコートします。すぐにBSA溶液を取り除き、チューブを氷の上に置きます。次に、細胞マトリックス溶液とオルガノイド培養液を氷上で解凍し、48ウェルオルガノイド培養板の各ウェルから培養液を慎重に除去する。
細胞マトリックスを溶解するために精力的にピペットする前に、冷たいPBSの1ミリリットルでそれぞれをよく洗います。比較的均質な細胞懸濁液が得られた場合、遠心分離により新鮮なPBSでオルガノイドを2回洗浄し、各オルガノイド培養物を40マイクロリットルの冷媒で再懸濁する。大きなオルガノイド構造を10マイクロリットルピペットチップを5回解化し、40~60マイクロメートルの大きさの構造を収集し、各オルガノイド懸濁液を40マイクロリットルの新たに調製したセルマトリックス溶液と混合します。
各オルガノイド細胞マトリックス溶液懸濁液を8つのウェルチャンバーカバースリップの個々の井戸の中央に加え、スライドをアイスパックの上に5分間置きます。インキュベーションの終わりに、スライドを摂氏37度、炭酸ガス5%を20分間置き、オルガノイド細胞マトリックス構造の重合を可能にしてから、細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートするために各ウェルに150マイクロリットルのオルガノイド培養培地を添加する。インキュベーションの終了時に、正のコントロールウェルを、組換えマウスインターフェロンガンマの1ミリリットルあたり10ナノグラムで48時間治療します。
透過性アッセイを行うため、チャンバーカバースリップを反転共焦点顕微鏡の37°C加温インキュベーションチャンバーに移し、チャンバーの二酸化炭素を顕微鏡のステージにしっかりとロックして顕微鏡の1ウェルでオルガノイドを視覚化するように設定します。次に、作りたての100ミリモルルルシファーイエローを150マイクロリットルの培地に3マイクロリットル加え、顕微鏡室に1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、基準オルガノイドのルーメンを視覚化するために焦点を合わせ、ルシファー黄色の励起に必要なレーザーエネルギーと、ルシファーイエロー信号を機器の利用可能なダイナミックレンジの30〜40%で画像化するための機器のそれぞれの検出感度を定義します。
あるいは、信号強度は露光時間を変更することで変更することができる。微分干渉対ライブイメージングによって、カバースリップ表面に近い球状構造を有する約10個のオルガノイドの位置を見つけ、同等の直径のオルガノイドを捕獲し、オルガノイドの中央スライスに焦点を合わせ、内腔を画像化する。各オルガノイドの形状と自動蛍光を記録するために、各位置の差動干渉コントラストとルシファー黄色蛍光を記録します。
すべてのオルガノイドが画像化されたら、ルシファーイエローを含む150マイクロリットルの培地をルシファーイエローの治療井戸に加え、5分ごとにすべての井戸を70分間画像化します。イメージングセッションの終了時に、調製したEGTAを4マイクロリットルの培地に100マイクロリットル加えます。希釈したEGTAを適切なウェルに加えます。
次に、オルガノイドの蛍光を5分毎に30分間記録する。細胞の生存率と完全性がアッセイの成功の前提条件であるとして、取り扱いと培養またはオルガノイドを事前に実践してください。本代表的実験では、ルシファー黄色の内皮ルシファー黄色蛍光で70分間の治療の後、インターフェロンガンマで処理された野生型動物のオルガノイドでのみ見える。
非刺激性コントロールも、インターフェロンガンマ受容体-2ノックアウト動物由来のオルガノイドも、治療期間の終わりに内アルミナルルシファー黄色蛍光を示さなかった。EGTAの添加は、狭い接合部の共因子を隔離することによって腸壁の完全性の非特異的な崩壊を引き起こし、起源または治療条件に関係なく、すべてのオルガノイドにおけるルシファー黄色の取り込みおよび発現をもたらした。オルガノイド腔内および各オルガノイドの外側のルシファー黄色蛍光レベルの相対強度値も定量化することができる。
構成の周りに同等のサイズのオルガノイドを選択し、オルガノイドの中央の内腔を想像できるように、設定された軸を選択してください。腸バリア破壊を誘発する物質を用いれば、腸バリア破壊の抑制に関する戦略も調べることができる。この方法論は単一の動物からの初等細胞に基づいているので、多くのアッセイに使用することができ、各実験に必要な動物の数を減らすことができる。
