最高の電子アクセクターとして、酸素は生物学的システムにおいて重要な役割を果たします。このプロトコルを使用すると、オプトデを使用して2Dで酸素分布をイメージすることができます。高い空間分解能と時間分解能に加えて、この方法は追加の参照色素を必要とせず、非常に堅牢であり、構造画像の取得を可能にする。
この方法は、酸素が生態学、医学研究、バイオプリンティング、感圧印刷などの重要な役割を果たす研究分野に適用できます。サポートホイルとナイフコーティング装置のドラッグ速度に追加されるカクテルの量は、最適化と実践を必要とすることができるので、光度の製造は困難な場合があります。このビデオの投稿により、この強力な技術を他の研究分野の研究者が利用できるようにしたいと考えています。
平らな酸素オプトデを準備するには、まず水または70%エタノールのフィルムを使用して、きれいなガラス板にきれいなほこりのないPETホイルを固定します。ホイルに清潔な120マイクロメートルのナイフコーティング装置を置き、ガラスピペットを使用してデバイスの前面にセンサーカクテルのラインを適用します。次に、PETホイルの上にゆっくりと均一にナイフコーティング装置をドラッグして、カクテルを均等に広げます。
その後、完成した平面酸素感受性光物を周囲の空気中で1時間乾燥させてから、加熱されたキャビネットで摂氏50~60度で一晩乾燥させます。翌朝までに、約12マイクロメートルの厚層が得られる。光から保護された光を、さらに使用するまで保管してください。
根茎サンドイッチチャンバーを準備するには、軽い硬化性アクリルベースのインスタント接着剤を使用して、1つの長いエッジを開いたままにしてガラス板の端に沿って顕微鏡スライドを接着します。接着された顕微鏡スライド間のスペースに収まるように、必要な形状とサイズに平面のオプトデをカットし、上向きにコーティングされた側面とフロントガラスプレートの内側にオプトデを配置します。ガラス板にオプトデ箔の1つの端をテープし、ガラス板とオプトデ箔の間に水道水を加えます。
ゆっくりと水滴にホイルを下げ、検眼機がガラス表面にまっすぐにし、柔らかい組織を使用して、オプトデとプレートの間に閉じ込められた気泡を慎重に取り除きます。その後、ガラス板を乾かして拭き取り、残りのホイルの端をプレートにテープで貼ります。次に、平らなガラス板を使用して、0.5ミリメートルのふるいの堆積物を顕微鏡スライドスペーサーと同じ厚さにプレート全体に均等に分配します。
慎重に顕微鏡スライドの上面を洗浄し、第2のガラス板がチャンバーを適切に密封し、シリコングリースを顕微鏡スライド表面に塗布するようにします。その後、慎重に気泡の形成を避けながら、水の薄膜で堆積物をカバーしています。サンプルを堆積物の上に置く前に、リトレーラ・アンイフローラの1回の撮影を慎重に洗い、上の開いた側から葉が突き出た土砂に撮影を置きます。
サンプルが所定の位置にある場合は、オプトデ付きのガラス板を堆積物の上に置き、穏やかな圧力をかけ、植物の根と周囲の堆積物と密接に接触するようにします。クランプを使用してプレートを一緒に固定し、ティッシュペーパーで外側の端を乾燥させます。根茎サンドイッチの組み立て全体に植物を水分補給し、ビニール電気テープを使用して根茎サンドイッチチャンバーを締めるために葉に水を数滴繰り返し加えます。
次に、モデリング粘土と追加の電気テープでエッジを密封します。イメージングの準備として、インキュベーション後に光板領域からカバーホイルを取り出し、光板を水槽の壁に直立したガラス壁に根茎サンドイッチチャンバーを配置します。壁に対して根茎サンドイッチチャンバーを押すためにスペーサーを使用してください。
水族館と対象領域の前に目的を装備した周波数ドメインベースの発光寿命カメラを配置します。インジケータの色素をカメラの目的にイメージングするための適切なエミッションフィルタを取り付け、LED励起源の導光部を固定します。次に、ガイドを配置して、対象領域を覆う平面光化箔を均等に照らします。
イメージングソフトウェアでカメラを選択し、LED制御ソフトウェアでLEDを選択します。必要に応じて LED の強度を設定し、アナログと同期を刻んで、外部トランジスタ/トランジスタ ロジックによって LED がトリガーされることを確認します。カメラを手動でフォーカスし、目的の絞りを調整し、内部変調源、出力波形の正音波、追加の位相サンプリング、8相サンプル、逆の位相、A B読み出し、5キロヘルツ変調周波数を設定します。
正規化された発光強度画像の対象領域統計読み出しが 0.68 ~ 0.72 の範囲になるまでの露光時間を調整します。次に、[参照をキャプチャ] をクリックして、参照測定シリーズの取得を開始します。光を較正するには、ガス混合装置を使用して、酸素センサーを用いて外部プローブで酸素濃度を監視する既知の酸素濃度を持つ周囲空気窒素ガス混合物を用いて、校正水槽内の水を洗い流します。
次に、キャリブレーションチャンバー内の異なる酸素濃度で一連の画像を取得し、取得したキャリブレーションデータに適切なカーブフィットを得ます。システムが較正されたら、植物および他のすべての光源に照射するライトを消し、画像の強度に基づいて取得時間を調整し、信号が過飽和でも弱すぎもないようにして、寿命決定において良好な信号対雑音比を確保します。すべての酸素寿命画像が取得されたら、ライトを再びオンにして構造画像を取得し、視野の定規を持つ画像を取得して、取得した画像の後続のスケーリングを可能にします。
サンプルをイメージングする前に、光は較正する必要があります。準指数関数的な崩壊の後、測定された発光寿命は酸素濃度が増加するにつれて減少する。この関係は、簡略化された 2 つのサイト モデルを使用して記述することもできます。
光量が較正されると、リトレージャ・アンイフローラの根層圏における酸素濃度の分布が12時間及び12時間後に毎秒500マイクロモル光子に光を浴びた後に画像化されたこれらの画像で観察された発光寿命を画像化することによって酸素濃度を決定することができる。寿命画像に加えて、イメージングジオメトリを固定したまま、外部照明下で構造画像を取得して、酸素イメージングを構造画像と正確に相関させることができます。例えば、単一の根を横切る酸素濃度プロファイルは、暗闇と光の中で取得した画像から抽出することができます。
不要なアーティファクトを避けるために、サンプル行列と検眼との間に良好な接触を持つことは重要です。疑問がある場合は、サンドイッチを作り直してください。非破壊的な方法で画像を瞬時に取得することで、酸素環境のモニタリングが可能になります。
この方法は、pHまたは他の検体の他の検眼と組み合わせられるかもしれません。センサーカクテルにはクロロホルムが含まれているため、フュームフードで光物加工を行ってください。平面オプトデは、堆積物中の微生物群集を同定するために使用することができる。
そして、イメージングの後、サンドイッチは微生物群集分析のためにこれらのホットスポットをサンプリングするために開くことができる。
