Name: fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells
Uploaded: 2012-02-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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MKKは、個人フェローシップ英国の工学物理科学研究評議会（EPSRC）ライフサイエンスインタフェースプログラムに感謝します。我々はまた、英国のバイオテクノロジー·生物科学研究会議（BBSRC）によって資金調達を承認したいと思います。

FLIMのサンプル調製のためのプロトコルは、共焦点またはワイドフィールド強度ベースの蛍光顕微鏡とは異なりません。データ収集は、すなわち生データから蛍光寿命を抽出し、データ解析の主なタスクは続いています。一度これらが得られた、データの解釈は仮説を検証したり改ざんするのに役立ちます。 1。分子ローター染色細胞<ol><li>正確なバランスとピペットを用いて6,7の適切な溶媒（BODIPY-C 12例えばメタノール）中の染料の約1 mg / mlを溶解させたストック溶液（10 ml）を準備します。 </li><li>染色された細胞は、（我々の場合のモデル癌細胞株、HeLa細胞）〜80％コンフルエントになるまで、5％CO 2雰囲気下で37℃インキュベーターでは、顕微鏡用coverslide下面にマルチウェルプレートに上に栽培されています。 </li><li> 10を追加 - マルチWELで成長し、生きた細胞にストック溶液20μlを6ウェルプレートのウェルあたりのOpti-MEM培地（GIBCO）を4 mlのLプレート（50 SmartSlideマイクロインキュベーションシステムWafergen）。これはよくマイクロモルの色素濃度が得られます。 </li><li>染色のための10から45分間、5％CO 2雰囲気下で37℃インキュベーターにマルチウェルプレートを返します。 </li><li>インキュベーターからマルチウェルプレートを取り外し、過剰な色素を除去するために4ミリリットル光学的に透明な細胞培養培地（例えばのOpti-MEM）で細胞を3〜4回​​洗浄する。 </li><li>顕微鏡のステージにマルチウェルプレートを転送し、必要に応じて画像の準備のために、温度コントローラ/ 5％CO 2ガス入口に接続します。 </li></ol> 2。細胞内の蛍光分子ローターのFLIM <ol><li>顕微鏡ステージ上にサンプルを配置し、伝送および蛍光細胞を識別するための蛍光画像を取得します。実験のセットアップの模式図を図に示されています。 1.Verifyその場所EXPEから蛍光が放出さCTED（例えば、細胞膜、細胞質）。蛍光発光スペクトルを取得し、それがこのケースでは、染料やタンパク質の期待している分子ローターのスペクトルであることを確認します。陰性対照として、画像の非染色したサンプルを、それが蛍光を発するないことを確認してください。このステップはFLIMのために特別に必須ではありませんが、それは一般的に良い習慣であり、サンプルでは、​​それは考えるものであることを確認するのに役立ちます。 </li><li> FLIMモードに切り替え - これは容易に蛍光検出光路（ライカTCS SP2取得制御ソフトウェアの &quot;ビーム·パスの設定&quot;パネルの &quot;外部検波器&quot;ボタン）のミラーを移動することによって達成されます。検出器に到達するから励起光を遮断するための適切な蛍光発光フィルタは、蛍光検出beampathでなければなりません。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> 図1 ACアダプタを使ってタイム·ドメインFLIMのための実験装置onfocalレーザー走査顕微鏡。 <ol start="3"><li>サンプルをスキャンし、検出器の計数率（ベッカー＆Hickl SPC 830ボードの取得制御ソフトウェアにCFDというラベルの付いた黒いバー）はこれ以上のレーザ繰り返し周波数の約1％（以上ではないこと、FLIMの取得を制御するコンピュータ上で、チェックSYNC取得制御ソフトウェアラベル緑のバー）。されている場合は、パイルアップ歪ん蛍光減衰曲線を収集を避けるために、レーザービームのパスに中立的な密度フィルタを置くことによって、例えば、レーザー励起強度を、減らすことができます。 </li><li>通常3〜5分間、FLIMのイメージを取得し、スキャンを停止し、生データ（3次元データ空間座標xとyから成る &quot;キューブ&quot;、時間）を保存します。 </li><li>蛍光強度イメージを表示するには、例のTRI-2 14または商用ソフトウェアでは、蛍光減衰解析ソフトウェア·パッケージ内の生データを開きます。これは単純に統合された蛍光減衰であり、それぞれには、蛍光減衰曲線下の面積、すなわちピクセル。 </li><li>それの上にカーソルを置くことによって、典型的なピクセルを選択し、そのピクセルの蛍光減衰を調べてください。ピークカウントが100未満の場合、画素の空間ビニングを使用しています。隣接する画素（例えば、3x3または5x5の）のカウントが高いピークカウントがが得られるように、中央のピクセルに追加されます。これは、次のステップのために高い統計精度を提供します。また、測定は長い捕捉時間（ステップ5）のために繰り返される可能性があります。 30 50分のために、約10倍のピーク数（および合計数）が得られますが、これはためサンプルの動きに起因するアーチファクトを導入する危険性をはるかに多くの生物学的サンプルの収集時間が長すぎる、顕微鏡ドリフトされ、光毒性と退色。 </li><li>グローバルピクセルのしきい値を（ピクセルで減衰が装着されている上記）を選択し、画像への単一の指数関数的減衰フィットを適用します。結果はその後でエンコードされているしきい値は、上記の各ピクセルの蛍光寿命が得られます色を指定します。各ピクセルは、フィットの結果で彩られ、FLIMマップが得られます。さまざまなピクセルの縮小カイ二乗値を確認します - 1（および​​最大1.3）の周りには良いフィット感を示しています。ランダムゼロの周りに分配されるべきである対応する残差を、点検してください。 </li><li>特定の蛍光寿命は蛍光寿命自体に対し、発生する頻度を蛍光寿命のヒストグラムをプロットします。蛍光寿命分布は色の範囲に収まるように色の範囲を調整します。 </li><li> monoexponentialフィットが約1のカイ二乗値（および最大1.3）を得ませんし、ゼロからの残差の系統的な偏差がある場合は、より洗練されたモデルが必要となります。たとえば、また一つに色素の相対量の指示を与える前の指数因子や振幅が得られますプローブはフィットインチかもしれない2つの異なる環境を考慮して、蛍光減衰に二重指数関数モデルを当てはめてみてください環境メンターや他の。また、延伸指数関数では、蛍光寿命の分布を説明するために適切であるかもしれません。 </li><li>各ピクセルの蛍光寿命は、事前指数因子、および寿命比と前の指数係数比の結果は、カラーでエンコードすることができます。各ピクセルは、その値に応じて着色し、蛍光寿命、事前指数因子およびそれらの比に起因するコントラストが得られます。優れたフィット感を示しています約1（および​​最大1.3） - 再び、減少カイ二乗値（また、色でコード化され、画像として表示することができる）をチェックしてください。ランダムゼロの周りに分配されるべきである残差を、点検してください。 </li><li>蛍光寿命のヒストグラムは、平均蛍光寿命の値を簡単に可視化するためのすべての画像、および蛍光寿命分布を伴うべきである。 </li></ol> 3。代表的な結果を測定し、蛍光減衰メタノール/グリセロール混合物の粘度を増加させるに蛍光分子ロータは図に示されています。 2。蛍光減衰はmonoexponentialであり、蛍光寿命は、粘度の関数として著しく変化します。これは、メタノール中で約300ピコ秒（粘度0.6 CP）から95％グリセロール（粘度950 cP）の3.4 nsに増加します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> 図2粘度を変化させたメタノール/グリセロール混合物のBODIPY-C 12の蛍光減衰のプロファイル6。 蛍光寿命の対数のキャリブレーションプロットはτ対蛍光分子ロータの粘度ηを図に示されています。 3。フェルスターホフマン式（9）で求められるように、それは直線です。 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="式（1）" /> kは0 radiativですeの速度定数、 および zとxは 0 &lt;x &lt;1で、定数である。両側の利回りに対数をとる<img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="式（2）" /> ここで、x は直線の勾配です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> BODIPY-C 12収量フェルスター·ホフマン式に従って直線のログ蛍光寿命対ログ粘度の3プロット図 6。 蛍光分子ローターと生きている細胞のインキュベーションに続いて点状の色素の分布が蛍光画像で観察される。メソ置換BODIPY色素と共にインキュベートしたHeLa細胞のFLIMイメージは図に示されています。 4。画像の各ピクセルの蛍光減衰が十分に単一の指数関数的減衰モデルを使用して取り付けることができます。 図4（a）の蛍光強度とBODIPY-C 12で染色したHeLa細胞の（b）のFLIMの画像。明るい、強調する領域は、他の地域よりも短い寿命を示す。この短いliftimeはフェルスター·ホフマン式に従って、涙点の低い粘度は、おそらく脂質滴に対応しています。 図に示すように、すべてのピクセルから抽出された寿命をプロットすることにより、我々は、画像全体の蛍光寿命のヒストグラムを取得します。 5。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> 図5。メソ置換BODIPY分子ローターで染色したHeLa細胞のFLIM画像からの蛍光寿命のヒストグラム。

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利害の衝突が宣言されません。

FLIMは、強度ベースの蛍光イメージング上でいくつかの重要な利点を提供しています。それが蛍光体の濃度の影響からそれらを分離することができるため、蛍光強度イメージングによって観察することが困難または不可能な光物理的イベントに報告することができます。これはイメージング蛍光分子ローターによって細胞内の粘度をマッピングするために特に有用である。図に示すように、蛍光寿命は、容易に、検量線を用いた粘度に変換することができます。 3、蛍光分子ローターの濃度に依存しない。 FLIMでは、データの解釈を複雑にするかもしれないアーティファクトがあるかもしれません10インストゥルメンタルのアーティファクトは、蛍光減衰の始まりの上にピークとして表示されますと短いディケイ·タイムと混同されることがある散乱光、または後に小さなピークが含まれてい顕微鏡内部の反射によって引き起こされるかもしれIRF。これらの散乱光のアーティファクトは、そのように識別することができますので、彼らは、スペクトル差別と区別することができます - 彼らは励起光と同じ波長に常にある。空気中で、光は1ナノ秒は30センチメートルを移動することを思い出しては、反射の原因を突き止めるのに役立ちます。 フィルタやガラスの蛍光は、特に低いサンプルの蛍光で、アーティファクトを引き起こす可能性がありますが、これは簡単にサンプルすることなく測定を行うことにより識別できます。減衰は、これらの状況下で得られた場合、それは楽器によるものであるとは何の関係もありませんサンプルで！一方、サンプルの蛍光も蛍光減衰に寄与する可能性があることに注意してください。 時間相関単一光子計数（TCSPC）では、タイム·ツー·振幅変換器（TAC）の非直線性が悪く発作を引き起こす可能性がありますが、励起をブロックし、周囲の光を照らすことによって識別することができ、サンプル上に送信された光源からの例とタイミングを測定します。一定の背景がなければなりません画像の各画素で得られた。一定の背景からの逸脱が発生した地域は、優れたフィット感を得られないだろうと彼らはTCSPCカードのパラメータを調整することによって排除することができない場合、測定のために避けるべきである。 TCSPCの1つの悪名高いアーティファクトが高すぎる光子検出率によって引き起こされる光子パイルアップです。11,12これはエレクトロニクスが忙しい時期、最初の光子を処理しているため、後続の光子を無視して、タイムアウトしている最初の光子につながる。蛍光寿命の短縮、これを回避する最善の方法にパイルアップリードはレーザーの繰り返し率の1％前後で光子計数率を維持することです。 見通しそこにFLIMの様々な実装があり、そのため、アプリケーションに応じて、それぞれに長所と短所があります。 図13は、理想的な蛍光顕微鏡は、全体の多次元蛍光emissioを取得したい単一光子感度、最大空間分解能と最小のアクイジション時間を持つ単一の測定の強度、位置、寿命、波長と偏光のn個の輪郭。そこにこの機能のユニークな組み合わせとの技術は現在ありません、1つはインスツルメンテーション開発者のための課題として残って構築する。細胞生物学における重要な問題への新しい物理的手法の適用は、しばしば予期しない発見へのパスであり、我々は細胞生物学のための蛍光イメージングの飽和機能を近いするまでに長い道のりがあります。実際、このような寿命、スペクトルと偏光と同様に、高い空間分解能で3Dでより迅速イメージングなどのイメージング蛍光パラメータは、細胞生物学の新しい側面を明らかにするために確信しています。

蛍光分子ローターを使用したサンプルハードウェア： 反転ライカTCS SP2共焦点走査型顕微鏡コヒーレントミラ900のTi：ヴェルディV6ポンプレーザまたは浜松PLP-10の470ピコ秒パルスダイオードレーザ励起源とサファイアフェムト秒レーザーベッカー＆Hickl SPC 3GHzの830ボードは、Pentium IV、Windows XPと1GBのRAMコンピュータ浜松H5773P-01顕微鏡のX1ポートに取り付けられた光電子増倍管、またはハイブリッド検出器に基づく冷却ベッカー＆Hickl PMC100-01検出器ヘッド DCC 100検出器制御モジュールソフトウェア： TRI-2 14またはベッカー＆HicklによってSPCImage 2.8

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

拡散は、多くの場合、化学反応または生物学的プロセスにおいて重要な律速段階である細胞内のイベントの広い範囲で役割を果たしています。粘度は、分子やタンパク質の拡散に影響を与える重要なパラメータの一つであり、粘度の変化が細胞レベルで病気や機能不全にリンクされている1-3バルク粘度を測定する方法がよく発達している間に、イメージング微小粘度が課題である。最近取得しにくかったまでは、単一細胞のような微細な物体の粘度マップは、持っています。他の光学技術と同様に、それが非破壊、低侵襲であり、生きた細胞や組織に適用することができます、ので、蛍光技術を使用して、マッピングの粘度が有利である。 蛍光分子ローターは蛍光寿命とその微小環境の粘度の関数である量子収率を示す。4,5分子内ねじれまたは回転は励起状態のバックから基底状態への非放射性崩壊につながります。粘性のある環境では、この非放射減衰経路へのアクセスを制限し、この回転やねじれが遅くなります。これは、蛍光量子収率と蛍光寿命の増加につながる。蛍光分子ローターがこれらのプローブの蛍光寿命は、その環境の微小粘度の関数であることを示すように行動する変更された疎水性のBODIPY色素の蛍光寿命イメージング（FLIM）6-8溶媒粘度の収量に対する蛍光寿命の対数プロットフェルスターホフマン式に従う直線。9このプロットは、また粘度に蛍光寿命を変換するための検量線として機能します。 変更されたBODIPY蛍光分子ロータと生きている細胞のインキュベーションに続いて、点状の色素分布を蛍光画像で観察される。目で得られた粘度値生細胞の電子涙点は、水および細胞質のそれより約100倍である。6,7時間分解蛍光異方性の測定は、これらの大きな微小粘度の値と一致した回転相関時間を得ることができます。蛍光寿命をマッピングすると蛍光強度とは独立であり、従って、プローブ濃度と粘度の影響を分離することができます。 要約では、蛍光分子ローターのFLIMに基づいて、細胞内の微小粘度をマッピングするための実用的かつ多彩なアプローチを開発しました。

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

蛍光寿命イメージング（FLIM）はイメージに重要な手法として、生きた細胞内の特定のタンパク質と色素の環境との相互作用を浮上している。蛍光分子ローターのFLIMは、生体細胞内の粘度のマッピングを可能にします。

生細胞における分子ローターの蛍光寿命イメージング

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.9K ビュー.  King's College London. 蛍光寿命イメージング（FLIM）はイメージに重要な手法として、生きた細胞内の特定のタンパク質と色素の環境との相互作用を浮上している。蛍光分子ローターのFLIMは、生体細胞内の粘度のマッピングを可能にします。

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

生物工学

Probing Metabolism and Viscosity of Cancer Cells using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Viscosity is an important physical property of a biological membrane, as it is one of the key parameters for the regulation of morphological and physiological state of living cells. Plasma membranes of tumor cells are known to have significant alterations in their composition, structure, and functional characteristics. Along with dysregulated metabolism of glucose and lipids, these specific membrane properties help tumor cells to adapt to the hostile microenvironment and develop resistance to drug therapies. Here, we demonstrate the use of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to sequentially image cellular metabolism and plasma membrane viscosity in live cancer cell culture. Metabolic assessments are performed by detecting fluorescence of endogenous metabolic cofactors, such as reduced nicotinamide adenine dinucleotide NAD(P)H and oxidized flavins. Viscosity is measured using a fluorescent molecular rotor, a synthetic viscosity-sensitive dye, with a strong fluorescence lifetime dependence on the viscosity of the immediate environment. In combination, these techniques enable us to better understand the links between membrane state and metabolic profile of cancer cells and to visualize the changes induced by chemotherapy.

Here, we demonstrate the use of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to sequentially image cellular metabolism and plasma membrane viscosity in live cancer cell culture. Metabolic assessments are performed by detecting endogenous fluorescence. Viscosity is measured using a fluorescent molecular rotor.

Viscosity is an important physical property of a biological membrane, as it is one of the key parameters for the regulation of morphological and ...

がん研究

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

生化学

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

免疫・感染学

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced nicotinamide adenine (phosphate) dinucleotide (NAD(P)H) and oxidized flavin adenine dinucleotide (FAD) are coenzymes of metabolic reactions. NAD(P)H and FAD exhibit autofluorescence and can be spectrally isolated by excitation and emission wavelengths. Both coenzymes, NAD(P)H and FAD, can exist in either a free or protein-bound configuration, each of which has a distinct fluorescence lifetime-the time for which the fluorophore remains in the excited state. Fluorescence lifetime imaging (FLIM) allows quantification of the fluorescence intensity and lifetimes of NAD(P)H and FAD for label-free analysis of cellular metabolism. Fluorescence intensity and lifetime microscopes can be optimized for imaging NAD(P)H and FAD by selecting the appropriate excitation and emission wavelengths. Metabolic perturbations by cyanide verify autofluorescence imaging protocols to detect metabolic changes within cells. This article will demonstrate the technique of autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD for measuring cellular metabolism.

This protocol describes fluorescence imaging and analysis of the endogenous metabolic coenzymes, reduced nicotinamide adenine (phosphate) dinucleotide (NAD(P)H), and oxidized flavin adenine dinucleotide (FAD). Autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD provides a label-free, nondestructive method to assess cellular metabolism.

細胞代謝を評価するための自己蛍光イメージング

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

神経科学

FLIMベースの代謝および低酸素分析のための多細胞スフェロイド形成

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

著者スポットライト:蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いた代謝および酸素化分析のためのスフェロイド形成法の標準化(英語)

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

ライブ細胞におけるコンソジショナルフレットバイオセンサーを用いたオーロラキナーゼ活性化のリアルタイムモニタリング

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...

生細胞における分子ローターの蛍光寿命イメージング

要約

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マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

Probing Metabolism and Viscosity of Cancer Cells using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

細胞代謝を評価するための自己蛍光イメージング

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

ライブ細胞におけるコンソジショナルフレットバイオセンサーを用いたオーロラキナーゼ活性化のリアルタイムモニタリング