MKKは、個人フェローシップ英国の工学物理科学研究評議会（EPSRC）ライフサイエンスインタフェースプログラムに感謝します。我々はまた、英国のバイオテクノロジー·生物科学研究会議（BBSRC）によって資金調達を承認したいと思います。

FLIMのサンプル調製のためのプロトコルは、共焦点またはワイドフィールド強度ベースの蛍光顕微鏡とは異なりません。データ収集は、すなわち生データから蛍光寿命を抽出し、データ解析の主なタスクは続いています。一度これらが得られた、データの解釈は仮説を検証したり改ざんするのに役立ちます。 1。分子ローター染色細胞<ol><li>正確なバランスとピペットを用いて6,7の適切な溶媒（BODIPY-C 12例えばメタノール）中の染料の約1 mg / mlを溶解させたストック溶液（10 ml）を準備します。 </li><li>染色された細胞は、（我々の場合のモデル癌細胞株、HeLa細胞）〜80％コンフルエントになるまで、5％CO 2雰囲気下で37℃インキュベーターでは、顕微鏡用coverslide下面にマルチウェルプレートに上に栽培されています。 </li><li> 10を追加 - マルチWELで成長し、生きた細胞にストック溶液20μlを6ウェルプレートのウェルあたりのOpti-MEM培地（GIBCO）を4 mlのLプレート（50 SmartSlideマイクロインキュベーションシステムWafergen）。これはよくマイクロモルの色素濃度が得られます。 </li><li>染色のための10から45分間、5％CO 2雰囲気下で37℃インキュベーターにマルチウェルプレートを返します。 </li><li>インキュベーターからマルチウェルプレートを取り外し、過剰な色素を除去するために4ミリリットル光学的に透明な細胞培養培地（例えばのOpti-MEM）で細胞を3〜4回​​洗浄する。 </li><li>顕微鏡のステージにマルチウェルプレートを転送し、必要に応じて画像の準備のために、温度コントローラ/ 5％CO 2ガス入口に接続します。 </li></ol> 2。細胞内の蛍光分子ローターのFLIM <ol><li>顕微鏡ステージ上にサンプルを配置し、伝送および蛍光細胞を識別するための蛍光画像を取得します。実験のセットアップの模式図を図に示されています。 1.Verifyその場所EXPEから蛍光が放出さCTED（例えば、細胞膜、細胞質）。蛍光発光スペクトルを取得し、それがこのケースでは、染料やタンパク質の期待している分子ローターのスペクトルであることを確認します。陰性対照として、画像の非染色したサンプルを、それが蛍光を発するないことを確認してください。このステップはFLIMのために特別に必須ではありませんが、それは一般的に良い習慣であり、サンプルでは、​​それは考えるものであることを確認するのに役立ちます。 </li><li> FLIMモードに切り替え - これは容易に蛍光検出光路（ライカTCS SP2取得制御ソフトウェアの &quot;ビーム·パスの設定&quot;パネルの &quot;外部検波器&quot;ボタン）のミラーを移動することによって達成されます。検出器に到達するから励起光を遮断するための適切な蛍光発光フィルタは、蛍光検出beampathでなければなりません。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> 図1 ACアダプタを使ってタイム·ドメインFLIMのための実験装置onfocalレーザー走査顕微鏡。 <ol start="3"><li>サンプルをスキャンし、検出器の計数率（ベッカー＆Hickl SPC 830ボードの取得制御ソフトウェアにCFDというラベルの付いた黒いバー）はこれ以上のレーザ繰り返し周波数の約1％（以上ではないこと、FLIMの取得を制御するコンピュータ上で、チェックSYNC取得制御ソフトウェアラベル緑のバー）。されている場合は、パイルアップ歪ん蛍光減衰曲線を収集を避けるために、レーザービームのパスに中立的な密度フィルタを置くことによって、例えば、レーザー励起強度を、減らすことができます。 </li><li>通常3〜5分間、FLIMのイメージを取得し、スキャンを停止し、生データ（3次元データ空間座標xとyから成る &quot;キューブ&quot;、時間）を保存します。 </li><li>蛍光強度イメージを表示するには、例のTRI-2 14または商用ソフトウェアでは、蛍光減衰解析ソフトウェア·パッケージ内の生データを開きます。これは単純に統合された蛍光減衰であり、それぞれには、蛍光減衰曲線下の面積、すなわちピクセル。 </li><li>それの上にカーソルを置くことによって、典型的なピクセルを選択し、そのピクセルの蛍光減衰を調べてください。ピークカウントが100未満の場合、画素の空間ビニングを使用しています。隣接する画素（例えば、3x3または5x5の）のカウントが高いピークカウントがが得られるように、中央のピクセルに追加されます。これは、次のステップのために高い統計精度を提供します。また、測定は長い捕捉時間（ステップ5）のために繰り返される可能性があります。 30 50分のために、約10倍のピーク数（および合計数）が得られますが、これはためサンプルの動きに起因するアーチファクトを導入する危険性をはるかに多くの生物学的サンプルの収集時間が長すぎる、顕微鏡ドリフトされ、光毒性と退色。 </li><li>グローバルピクセルのしきい値を（ピクセルで減衰が装着されている上記）を選択し、画像への単一の指数関数的減衰フィットを適用します。結果はその後でエンコードされているしきい値は、上記の各ピクセルの蛍光寿命が得られます色を指定します。各ピクセルは、フィットの結果で彩られ、FLIMマップが得られます。さまざまなピクセルの縮小カイ二乗値を確認します - 1（および​​最大1.3）の周りには良いフィット感を示しています。ランダムゼロの周りに分配されるべきである対応する残差を、点検してください。 </li><li>特定の蛍光寿命は蛍光寿命自体に対し、発生する頻度を蛍光寿命のヒストグラムをプロットします。蛍光寿命分布は色の範囲に収まるように色の範囲を調整します。 </li><li> monoexponentialフィットが約1のカイ二乗値（および最大1.3）を得ませんし、ゼロからの残差の系統的な偏差がある場合は、より洗練されたモデルが必要となります。たとえば、また一つに色素の相対量の指示を与える前の指数因子や振幅が得られますプローブはフィットインチかもしれない2つの異なる環境を考慮して、蛍光減衰に二重指数関数モデルを当てはめてみてください環境メンターや他の。また、延伸指数関数では、蛍光寿命の分布を説明するために適切であるかもしれません。 </li><li>各ピクセルの蛍光寿命は、事前指数因子、および寿命比と前の指数係数比の結果は、カラーでエンコードすることができます。各ピクセルは、その値に応じて着色し、蛍光寿命、事前指数因子およびそれらの比に起因するコントラストが得られます。優れたフィット感を示しています約1（および​​最大1.3） - 再び、減少カイ二乗値（また、色でコード化され、画像として表示することができる）をチェックしてください。ランダムゼロの周りに分配されるべきである残差を、点検してください。 </li><li>蛍光寿命のヒストグラムは、平均蛍光寿命の値を簡単に可視化するためのすべての画像、および蛍光寿命分布を伴うべきである。 </li></ol> 3。代表的な結果を測定し、蛍光減衰メタノール/グリセロール混合物の粘度を増加させるに蛍光分子ロータは図に示されています。 2。蛍光減衰はmonoexponentialであり、蛍光寿命は、粘度の関数として著しく変化します。これは、メタノール中で約300ピコ秒（粘度0.6 CP）から95％グリセロール（粘度950 cP）の3.4 nsに増加します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> 図2粘度を変化させたメタノール/グリセロール混合物のBODIPY-C 12の蛍光減衰のプロファイル6。 蛍光寿命の対数のキャリブレーションプロットはτ対蛍光分子ロータの粘度ηを図に示されています。 3。フェルスターホフマン式（9）で求められるように、それは直線です。 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="式（1）" /> kは0 radiativですeの速度定数、 および zとxは 0 &lt;x &lt;1で、定数である。両側の利回りに対数をとる<img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="式（2）" /> ここで、x は直線の勾配です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> BODIPY-C 12収量フェルスター·ホフマン式に従って直線のログ蛍光寿命対ログ粘度の3プロット図 6。 蛍光分子ローターと生きている細胞のインキュベーションに続いて点状の色素の分布が蛍光画像で観察される。メソ置換BODIPY色素と共にインキュベートしたHeLa細胞のFLIMイメージは図に示されています。 4。画像の各ピクセルの蛍光減衰が十分に単一の指数関数的減衰モデルを使用して取り付けることができます。 図4（a）の蛍光強度とBODIPY-C 12で染色したHeLa細胞の（b）のFLIMの画像。明るい、強調する領域は、他の地域よりも短い寿命を示す。この短いliftimeはフェルスター·ホフマン式に従って、涙点の低い粘度は、おそらく脂質滴に対応しています。 図に示すように、すべてのピクセルから抽出された寿命をプロットすることにより、我々は、画像全体の蛍光寿命のヒストグラムを取得します。 5。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> 図5。メソ置換BODIPY分子ローターで染色したHeLa細胞のFLIM画像からの蛍光寿命のヒストグラム。

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利害の衝突が宣言されません。

FLIMは、強度ベースの蛍光イメージング上でいくつかの重要な利点を提供しています。それが蛍光体の濃度の影響からそれらを分離することができるため、蛍光強度イメージングによって観察することが困難または不可能な光物理的イベントに報告することができます。これはイメージング蛍光分子ローターによって細胞内の粘度をマッピングするために特に有用である。図に示すように、蛍光寿命は、容易に、検量線を用いた粘度に変換することができます。 3、蛍光分子ローターの濃度に依存しない。 FLIMでは、データの解釈を複雑にするかもしれないアーティファクトがあるかもしれません10インストゥルメンタルのアーティファクトは、蛍光減衰の始まりの上にピークとして表示されますと短いディケイ·タイムと混同されることがある散乱光、または後に小さなピークが含まれてい顕微鏡内部の反射によって引き起こされるかもしれIRF。これらの散乱光のアーティファクトは、そのように識別することができますので、彼らは、スペクトル差別と区別することができます - 彼らは励起光と同じ波長に常にある。空気中で、光は1ナノ秒は30センチメートルを移動することを思い出しては、反射の原因を突き止めるのに役立ちます。 フィルタやガラスの蛍光は、特に低いサンプルの蛍光で、アーティファクトを引き起こす可能性がありますが、これは簡単にサンプルすることなく測定を行うことにより識別できます。減衰は、これらの状況下で得られた場合、それは楽器によるものであるとは何の関係もありませんサンプルで！一方、サンプルの蛍光も蛍光減衰に寄与する可能性があることに注意してください。 時間相関単一光子計数（TCSPC）では、タイム·ツー·振幅変換器（TAC）の非直線性が悪く発作を引き起こす可能性がありますが、励起をブロックし、周囲の光を照らすことによって識別することができ、サンプル上に送信された光源からの例とタイミングを測定します。一定の背景がなければなりません画像の各画素で得られた。一定の背景からの逸脱が発生した地域は、優れたフィット感を得られないだろうと彼らはTCSPCカードのパラメータを調整することによって排除することができない場合、測定のために避けるべきである。 TCSPCの1つの悪名高いアーティファクトが高すぎる光子検出率によって引き起こされる光子パイルアップです。11,12これはエレクトロニクスが忙しい時期、最初の光子を処理しているため、後続の光子を無視して、タイムアウトしている最初の光子につながる。蛍光寿命の短縮、これを回避する最善の方法にパイルアップリードはレーザーの繰り返し率の1％前後で光子計数率を維持することです。 見通しそこにFLIMの様々な実装があり、そのため、アプリケーションに応じて、それぞれに長所と短所があります。 図13は、理想的な蛍光顕微鏡は、全体の多次元蛍光emissioを取得したい単一光子感度、最大空間分解能と最小のアクイジション時間を持つ単一の測定の強度、位置、寿命、波長と偏光のn個の輪郭。そこにこの機能のユニークな組み合わせとの技術は現在ありません、1つはインスツルメンテーション開発者のための課題として残って構築する。細胞生物学における重要な問題への新しい物理的手法の適用は、しばしば予期しない発見へのパスであり、我々は細胞生物学のための蛍光イメージングの飽和機能を近いするまでに長い道のりがあります。実際、このような寿命、スペクトルと偏光と同様に、高い空間分解能で3Dでより迅速イメージングなどのイメージング蛍光パラメータは、細胞生物学の新しい側面を明らかにするために確信しています。

蛍光分子ローターを使用したサンプルハードウェア： 反転ライカTCS SP2共焦点走査型顕微鏡コヒーレントミラ900のTi：ヴェルディV6ポンプレーザまたは浜松PLP-10の470ピコ秒パルスダイオードレーザ励起源とサファイアフェムト秒レーザーベッカー＆Hickl SPC 3GHzの830ボードは、Pentium IV、Windows XPと1GBのRAMコンピュータ浜松H5773P-01顕微鏡のX1ポートに取り付けられた光電子増倍管、またはハイブリッド検出器に基づく冷却ベッカー＆Hickl PMC100-01検出器ヘッド DCC 100検出器制御モジュールソフトウェア： TRI-2 14またはベッカー＆HicklによってSPCImage 2.8

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

拡散は、多くの場合、化学反応または生物学的プロセスにおいて重要な律速段階である細胞内のイベントの広い範囲で役割を果たしています。粘度は、分子やタンパク質の拡散に影響を与える重要なパラメータの一つであり、粘度の変化が細胞レベルで病気や機能不全にリンクされている1-3バルク粘度を測定する方法がよく発達している間に、イメージング微小粘度が課題である。最近取得しにくかったまでは、単一細胞のような微細な物体の粘度マップは、持っています。他の光学技術と同様に、それが非破壊、低侵襲であり、生きた細胞や組織に適用することができます、ので、蛍光技術を使用して、マッピングの粘度が有利である。 蛍光分子ローターは蛍光寿命とその微小環境の粘度の関数である量子収率を示す。4,5分子内ねじれまたは回転は励起状態のバックから基底状態への非放射性崩壊につながります。粘性のある環境では、この非放射減衰経路へのアクセスを制限し、この回転やねじれが遅くなります。これは、蛍光量子収率と蛍光寿命の増加につながる。蛍光分子ローターがこれらのプローブの蛍光寿命は、その環境の微小粘度の関数であることを示すように行動する変更された疎水性のBODIPY色素の蛍光寿命イメージング（FLIM）6-8溶媒粘度の収量に対する蛍光寿命の対数プロットフェルスターホフマン式に従う直線。9このプロットは、また粘度に蛍光寿命を変換するための検量線として機能します。 変更されたBODIPY蛍光分子ロータと生きている細胞のインキュベーションに続いて、点状の色素分布を蛍光画像で観察される。目で得られた粘度値生細胞の電子涙点は、水および細胞質のそれより約100倍である。6,7時間分解蛍光異方性の測定は、これらの大きな微小粘度の値と一致した回転相関時間を得ることができます。蛍光寿命をマッピングすると蛍光強度とは独立であり、従って、プローブ濃度と粘度の影響を分離することができます。 要約では、蛍光分子ローターのFLIMに基づいて、細胞内の微小粘度をマッピングするための実用的かつ多彩なアプローチを開発しました。

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

蛍光寿命イメージング（FLIM）はイメージに重要な手法として、生きた細胞内の特定のタンパク質と色素の環境との相互作用を浮上している。蛍光分子ローターのFLIMは、生体細胞内の粘度のマッピングを可能にします。

生細胞における分子ローターの蛍光寿命イメージング

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.8K ビュー.  King's College London. 蛍光寿命イメージング（FLIM）はイメージに重要な手法として、生きた細胞内の特定のタンパク質と色素の環境との相互作用を浮上している。蛍光分子ローターのFLIMは、生体細胞内の粘度のマッピングを可能にします。

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

生物工学

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell death. These processes affect and are affected by the redox status of and ATP production by mitochondria. Here, we describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors that can detect mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells. Mitochondrial redox state is measured using redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP) that is targeted to the mitochondrial matrix. Mito-roGFP contains cysteines at positions 147 and 204 of GFP, which undergo reversible and environment-dependent oxidation and reduction, which in turn alter the excitation spectrum of the protein. MitGO-ATeam is a F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) probe in which the &epsilon; subunit of the FoF1-ATP synthase is sandwiched between FRET donor and acceptor fluorescent proteins. Binding of ATP to the &epsilon; subunit results in conformation changes in the protein that bring the FRET donor and acceptor in close proximity and allow for fluorescence resonance energy transfer from the donor to acceptor.

We describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors, which are based on GFP, to monitor mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells.

リビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPを測定レシオメトリックバイオセンサー

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

生細胞共役ポリマーにより電気的活動の光制御

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...