كما قبول أفضل الإلكترون، يلعب الأكسجين دورا حاسما في النظم البيولوجية. مع هذا البروتوكول، يمكنك صورة توزيع الأكسجين في 2D باستخدام optode. بالإضافة إلى دقة المكانية والزمانية العالية ، لا تتطلب هذه الطريقة صبغة مرجعية إضافية ، وهي قوية للغاية ، وتسمح بالحصول على صورة هيكلية.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على مختلف مجالات البحث التي يلعب فيها الأكسجين دوراً رئيسياً بما في ذلك علم البيئة والبحوث الطبية والطباعة الحيوية والطباعة الحساسة للضغط. يمكن أن يكون تلفيق optode تحدياً حيث أن كمية الكوكتيل المضافة إلى احباط الدعم وسرعة سحب جهاز طلاء السكين قد تتطلب التحسين والممارسة. مع هذا الفيديو المساهمة ، ونحن نريد أن تجعل هذه التقنية القوية في متناول الباحثين من مجالات أخرى للدراسة.
لإعداد optode الأكسجين مُنطَع، استخدم أولاً فيلم من الماء أو 70٪ الإيثانول لإصلاح رقائق PET نظيفة خالية من الغبار على لوحة زجاجية نظيفة. ضع جهاز طلاء سكين 120 ميكرومتر نظيف على احباط واستخدام ماصة زجاجية لتطبيق خط كوكتيل الاستشعار أمام الجهاز. المقبل، اسحب جهاز طلاء سكين ببطء وبشكل موحد على احباط PET لنشر كوكتيل بالتساوي.
ثم جفف optode الأكسجين المُنطَر المُنَهَج في الهواء المحيط لمدة ساعة واحدة قبل التجفيف بين عشية وضحاها في خزانة ساخنة عند 50 إلى 60 درجة مئوية. بحلول صباح اليوم التالي، سيكون قد تم الحصول على ما يقرب من 12 ميكرومتر طبقة سميكة. قم بتخزين optode المحمي من الضوء حتى الاستخدام الإضافي.
لإعداد غرفة rhizo-sandwich، استخدم لاصقة فورية خفيفة تعتمد على الأكريليك للصق شرائح المجهر على طول حواف لوحة زجاجية تترك حافة طويلة مفتوحة. قطع optode planar في الشكل والحجم المطلوبة لتناسب في الفضاء بين شرائح المجهر لصقها ووضع optode على داخل لوحة الزجاج الأمامي مع الجانب المغلفة صعودا. الشريط حافة واحدة من احباط optode إلى لوحة زجاجية وإضافة ماء الصنبور بين لوحة الزجاج واحباط optode.
خفض ببطء احباط على قطرات الماء مما يسمح لل optode لتصويب نفسها على سطح الزجاج واستخدام الأنسجة الرخوة لإزالة بعناية فقاعات الهواء المحاصرين بين optode واللوحة. ثم مسح لوحة زجاجية جافة وشريط حواف المتبقية من احباط لوحة. بعد ذلك، استخدم لوحة زجاجية مسطحة لتوزيع رواسب غربال 0.5 ملليمتر بالتساوي عبر اللوحة إلى نفس سمك تباعد شرائح المجهر.
تنظيف بعناية السطح العلوي من الشريحة المجهر لضمان أن لوحة الزجاج الثاني الأختام الغرفة بشكل صحيح وتطبيق الشحوم سيليكون على سطح الشريحة المجهر. ثم تغطية الرواسب مع طبقة رقيقة من الماء مع تجنب بعناية تشكيل فقاعات الهواء. قبل وضع عينة على الرواسب، وغسل بعناية تبادل لاطلاق النار واحد من uniflora Littorella ووضع تبادل لاطلاق النار على الرواسب مع الأوراق الشائكة من الجانب المفتوح العلوي.
عندما تكون العينة في مكانها، ضع اللوحة الزجاجية مع optode على الرواسب والضغط لطيف لجعل optode في اتصال وثيق مع جذور النبات والرواسب المحيطة بها. استخدم المشابك لربط اللوحات معًا وتجفيف الحواف الخارجية بورق الأنسجة. إضافة مرارا وتكرارا بضع قطرات من الماء إلى الأوراق للحفاظ على النبات رطب في جميع أنحاء الجمعية من ساندويش rhizo واستخدام الشريط الكهربائي الفينيل لتشد على غرفة rhizo ساندويتش.
ثم ختم حواف مع الطين النمذجة وشريط كهربائي إضافي. للتحضير للتصوير، وإزالة احباط تغطية من منطقة optode بعد الحضانة ووضع غرفة rhizo ساندويتش مع الجدار الزجاجي مع optode تستقيم ضد جدار الحوض. استخدام مُتباعدة للضغط على غرفة رهيزو ساندويتش ضد الجدار.
ضع كاميرا مدى الحياة التي تستند إلى مجال التردد مزودة بهدف أمام الحوض ومنطقة الاهتمام. إرفاق مرشح الانبعاثات مناسبة لتصوير صبغة المؤشر إلى هدف الكاميرا وإصلاح دليل الضوء في مصدر الإثارة LED. ثم ضع الدليل بحيث يضيء بالتساوي احباط optode اللوحي الذي يغطي منطقة الاهتمام.
في برنامج التصوير، حدد الكاميرا وحدد LED في برنامج التحكم في LED. تعيين كثافة LED حسب الحاجة ووضع علامة التناظرية والمزامنة لتأكيد أن يتم تشغيل LED من قبل منطق الترانزستور الخارجية. التركيز يدويا الكاميرا وضبط فتحة الهدف وتعيين مصدر التشكيل الداخلي، موجة جيبي للموجة الناتج، أخذ عينات المرحلة إضافية، عينات من ثماني مراحل، ترتيب المرحلة المعاكس، اضغط A B قراءات، وخمسة كيلو هرتز تردد التشكيل.
ضبط وقت التعرض حتى منطقة منطقة اهتمام إحصاءات قراءة للصورة كثافة التاشين تطبيع في نطاق 0.68 إلى 0.72. ثم انقر فوق التقاط مرجع لبدء الحصول على سلسلة قياس مرجع. لمعايرة optode، استخدم جهاز خلط الغاز لطرد الماء في حوض السمك معايرة مع خليط غاز النيتروجين الهواء المحيط مع تركيز الأكسجين المعروفة رصد تركيز الأكسجين مع مسبار خارجي مع جهاز استشعار الأكسجين.
ثم الحصول على سلسلة من الصور في تركيزات مختلفة من الأوكسجين في غرفة المعايرة للحصول على منحنى مناسب لمعطيات المعايرة المكتسبة. عندما يتم معايرة النظام، قم بإيقاف تشغيل الأضواء التي تطبق التشعيع على المصنع وجميع مصادر الضوء الأخرى وضبط وقت الاكتساب استنادًا إلى كثافة الصورة لضمان عدم تجاوز الإشارة أو ضعفها بشكل جيد بالنسبة لنسبة إشارة إلى ضوضاء في تحديد مدى الحياة. عندما تم الحصول على جميع الصور مدى الحياة الأكسجين، تشغيل الأضواء مرة أخرى للحصول على صورة هيكلية والحصول على صورة مع مسطرة في مجال الرؤية لتمكين التحجيم اللاحقة من الصور المكتسبة.
قبل تصوير العينة، يجب معايرة optode. بعد انحلال شبه أسي، يقلل عمر الإنارة المقاس مع زيادة تركيز الأكسجين. يمكن أيضاً وصف هذه العلاقة باستخدام نموذج الموقعين المبسط.
بمجرد معايرة optode ، من الممكن تحديد تركيز الأكسجين عن طريق تصوير عمر الإنارة كما لوحظ في هذه الصور التي تم فيها تصوير توزيع تركيز الأكسجين في رهيزوفير Littorella uniflora بعد التعرض للضوء 500 فوتونات ميكرومول لكل متر مربع في الثانية لمدة 12 ساعة وبعد 12 ساعة في الظلام. بالإضافة إلى الصور مدى الحياة، يمكن الحصول على الصور الهيكلية تحت الإضاءة الخارجية مع الحفاظ على هندسة التصوير ثابتة للسماح للتصوير الأكسجين أن تكون مرتبطة بدقة إلى الصورة الهيكلية. ويمكن بعد ذلك استخراج ملامح تركيز الأكسجين عبر جذر واحد على سبيل المثال من الصور المكتسبة في الظلام والضوء.
من المهم أن يكون هناك اتصال جيد بين مصفوفة العينة و optode لتجنب القطع الأثرية غير الضرورية. إذا كنت في شك، إعادة تشكيل شطيرة. يتيح الحصول الفوري على صورة بطريقة غير تدميرية مراقبة بيئة الأكسجين.
قد يكون الأسلوب كذلك جنبا إلى جنب مع optodes أخرى للhH أو غيرها من التحليلات. تأكد من تنفيذ تلفيق optode في غطاء الدخان كما يحتوي على كوكتيل استشعار الكلوروفورم. يمكن استخدام optodes بلانار لتحديد المجتمعات الميكروبية في الرواسب.
وبعد التصوير، يمكن فتح الساندويتش لتذوق هذه النقاط الساخنة لتحليل المجتمع الميكروبي.
