최고의 전자 수용자로서 산소는 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 합니다. 이 프로토콜을 사용하면 검증을 사용하여 2D로 산소 분포를 이미지화할 수 있습니다. 높은 공간 및 시간 적 해상도 외에도이 방법은 추가 참조 염료를 필요로하지 않으며 매우 견고하며 구조적 이미지를 수집 할 수 있습니다.
이 방법은 산소가 생태학, 의학 연구, 바이오 프린팅 및 압력에 민감한 인쇄를 포함하여 중요한 역할을하는 다양한 연구 분야에 적용 될 수 있습니다. 지지 호일 및 나이프 코팅 장치 드래그 속도에 추가된 칵테일의 양이 최적화 및 연습이 필요할 수 있기 때문에 광막 제작은 어려울 수 있습니다. 이 비디오 기여와 함께, 우리는 연구의 다른 분야의 연구원이 강력한 기술을 액세스 할 수 있도록하고 싶습니다.
평면 산소 압돌을 준비하려면 먼저 물 필름 또는 70 % 에탄올을 사용하여 깨끗한 유리 판에 깨끗한 먼지가없는 PET 호일을 고정하십시오. 깨끗한 120 마이크로미터 나이프 코팅 장치를 호일에 놓고 유리 파이펫을 사용하여 장치 앞에 센서 칵테일 라인을 적용합니다. 다음으로, 칼 코팅 장치를 PET 호일 위로 천천히 균일하게 드래그하여 칵테일을 고르게 펼습니다.
그런 다음 완성 된 평면 산소 에 민감한 검안을 주변 공기에서 1 시간 동안 건조한 후 50 섭씨에서 60도의 가열 된 캐비닛에서 밤새 건조하십시오. 다음날 아침까지 약 12마이크로미터 두께의 층이 얻어질 것입니다. 추가 사용까지 빛으로부터 보호된 검안을 저장합니다.
뿌리 덮개 샌드위치 챔버를 준비하려면 가벼운 치료 가능한 아크릴 기반 의 인스턴트 접착제를 사용하여 유리 판가장자리를 따라 현미경 슬라이드를 접착제로 사용하여 긴 가장자리를 열어 둡시하십시오. 평면 광판을 필요한 모양과 크기로 잘라 붙어 있는 현미경 슬라이드 사이의 공간에 맞고 코팅된 면을 위쪽으로 전면 유리 판 의 안쪽에 배치합니다. 압단 호일의 한쪽 가장자리를 유리 판에 테이프로 붙이고 유리 판과 압단 호일 사이에 수돗물을 추가합니다.
냄비가 유리 표면에 자신을 곧게하고 조심스럽게 검안과 접시 사이에 갇혀 기포를 제거하기 위해 부드러운 조직을 사용할 수 있도록 물방울에 호일을 천천히 낮춥다. 그런 다음 유리 판을 건조하게 닦고 호일의 나머지 가장자리를 접시에 테이프로 테이프로 놓습니다. 다음으로, 평평한 유리 판을 사용하여 0.5밀리미터 체 침전물을 플레이트 전체에 고르게 분포하여 현미경 슬라이드 스페이서와 동일한 두께로 분배합니다.
현미경 슬라이드의 상부 표면을 조심스럽게 청소하여 두 번째 유리 판이 챔버를 제대로 밀봉하고 현미경 슬라이드 표면에 실리콘 그리스를 적용합니다. 그런 다음 퇴적물을 얇은 물 필름으로 덮으면서 기포의 형성을 조심스럽게 피하십시오. 퇴적물 위에 샘플을 넣기 전에 Littorella uniflora의 한 번의 촬영을 조심스럽게 씻고 상단 열린 쪽에서 튀어 나와 있는 잎으로 퇴적물 위에 촬영을 배치하십시오.
시료가 제자리에 있을 때, 검안판이 있는 유리판을 퇴적물 위에 놓고 부드러운 압력을 가하여 식물 뿌리 및 주변 퇴적물과 밀접한 접촉으로 압단을 가져옵니다. 클램프를 사용하여 접시를 함께 고정하고 티슈 페이퍼로 외부 가장자리를 건조시다. 잎에 몇 방울의 물을 반복적으로 추가하여 식물을 뿌리 샌드위치 의 조립 내내 수분을 유지하고 비닐 전기 테이프를 사용하여 rhizo-샌드위치 챔버를 조입니다.
그런 다음 모델링 점토와 추가 전기 테이프로 가장자리를 밀봉합니다. 이미징을 준비하기 위해 인큐베이션 후 검안 영역에서 덮개 호일을 제거하고 수족관 벽에 대한 압장과 유리 벽으로 뿌리 덮개 샌드위치 챔버를 배치합니다. 스페이서를 사용하여 벽에 뿌리 줄기 샌드위치 챔버를 누릅니다.
수족관과 관심 영역 앞에 목표를 갖춘 주파수 도메인 기반 발광 수명 카메라를 배치합니다. 카메라 목표에 지표 염료를 이미징하기 위한 적절한 방출 필터를 부착하고 LED 여기 소스의 라이트 가이드를 수정합니다. 그런 다음 가이드를 배치하여 관심 영역을 덮는 평면 검안 포일을 균일하게 비춥습니다.
이미징 소프트웨어에서 카메라를 선택하고 LED 제어 소프트웨어에서 LED를 선택합니다. 필요에 따라 LED 강도를 설정하고 아날로그를 체크하고 동기화하여 외부 트랜지스터-트랜지스터 로직에 의해 LED가 트리거되는지 확인합니다. 수동으로 카메라를 집중하고 객관적인 조리개를 조정하고 내부 변조 소스, 출력 파형에 대한 죄파, 추가 위상 샘플링, 8상 샘플, 위상 차주 반대, 탭 A B 판독및 5킬로헤르츠 변조 주파수를 설정합니다.
정규화된 발광 강도 이미지에 대한 관심 통계 판독 영역이 0.68 에서 0.72 범위로 될 때까지 노출 시간을 조정합니다. 그런 다음 캡처 참조를 클릭하여 참조 측정 계열의 수집을 시작합니다. 광검을 보정하기 위해 가스 혼합 장치를 사용하여 산소 센서를 가진 외부 프로브로 산소 농도를 모니터링하는 공지된 산소 농도와 주변 공기 질소 가스 혼합물을 사용하여 교정 수족관에서 물을 플러시한다.
그런 다음 교정 챔버내의 상이한 산소 농도에서 일련의 이미지를 획득하여 획득된 교정 데이터에 적합한 곡선을 얻습니다. 시스템이 보정되면 플랜트 및 기타 광원에 조사를 적용하는 조명을 끄고 이미지의 강도에 따라 획득 시간을 조정하여 신호가 과포화되지도 않고 수명 측정시 신호 대 잡음 비율이 너무 약하지 않도록 합니다. 모든 산소 수명 이미지를 획득하면 조명을 다시 켜서 구조 이미지를 얻고 뷰 필드에 눈금자와 함께 이미지를 가져와 획득된 이미지의 후속 확장을 가능하게 합니다.
시료를 이미징하기 전에 검안증을 보정해야 합니다. 준 지수 부패에 따라, 측정된 발광 수명은 산소 농도가 증가함에 따라 감소합니다. 이 관계는 단순화된 두 사이트 모델을 사용하여 설명할 수도 있습니다.
일단 검증이 보정되면, 리토렐라 유니플로라의 뿌리부에서 산소 농도의 분포가 12시간 동안 초당 제곱된 미터당 500 마이크로몰 광자에게 광노출 후 심발화된 이러한 이미지에서 관찰된 바와 같이 발광 수명을 영상화하여 산소 농도를 결정할 수 있다. 평생 이미지 외에도, 구조적 이미지는 산소 이미징이 구조적 이미지와 정확하게 상관관계가 되도록 이미징 지오메트리를 고정시키면서 외부 조명 하에서 획득할 수 있습니다. 예를 들어 단일 루트에 걸쳐 산소 농도 프로파일은 어둠과 빛에서 획득 한 이미지에서 추출 할 수 있습니다.
불필요한 아티팩트를 피하기 위해 샘플 매트릭스와 검안 사이에 좋은 접촉을 하는 것이 중요합니다. 당신이 의심하는 경우, 샌드위치를 리메이크합니다. 비파괴적 방식으로 이미지를 즉각적으로 획득하면 산소 환경을 모니터링할 수 있습니다.
이 방법은 pH 또는 다른 멸문에 대한 다른 검소와도 결합될 수 있습니다. 센서 칵테일에 클로로폼이 포함되어 있기 때문에 연기 후드에서 광증 제작을 수행해야 합니다. 평면 광막퇴골에서 미생물 커뮤니티를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
그리고 이미징 후, 샌드위치는 미생물 지역 사회 분석을 위해 이러한 핫스팟을 샘플링하기 위해 열 수 있습니다.
