自然環境内の特定の骨細胞の遺伝子発現解析にレーザー捕捉マイクロ解剖の力を利用することを考えたことがありますか?ここでは、マウスの骨のクライオセクションから十分な量の高品質RNAを得ることができるプロトコルについて説明します。この技術は、遺伝子組み換えマウスモデルや疾患モデルにおける特定の骨細胞における遺伝子発現の変化を調べる素晴らしいツールです。
ここで説明するプロトコルは、マウスの骨に焦点を当てていますが、任意の種の任意の硬い組織の細胞における遺伝子発現をその際に研究するために使用することができます。この手順を実証するのに役立ちます, クリスチャンシューラー, 私の研究室からの技術者になります.全身麻酔下でマウスを排泄してマウスを安楽死させた後、大腿骨全体を迅速に除去する。
周囲の軟組織の大腿骨をきれいにするためにメスとペーパータオルを使用してください。次に、最適な切断温度化合物を埋め込み型に注ぎ、大腿骨を埋め込み金型の底に入れます。液体窒素でサンプルを凍結スナップします。
サンプルが完全に凍結したら、ホイルで包み、ドライアイスで冷凍庫に移します。さらに処理する準備ができるまでマイナス80°Cで保管してください。まず、クライオスタットの温度をマイナス19°C、ブロックホルダーの温度をマイナス17度に設定します。
次に、70%エタノールでクライオスタットの内部を拭き取ります。硬い組織、ガラススライド、および冷却するために凍結スタットにフィッティングツールのための使い捨てブレードを置き、切断の間、クライオスタットの中に保管します。凍結した組織ブロックをドライアイス上の凍結した組織ブロックをクライオスタットに移し、少なくとも10分間平衡化させます。
次に、埋め込み金型の底部を押して、OCT ブロックを金型から押し出します。ブロックホルダに十分なOCT培地を適用してブロックを固定し、OCTメディアが完全にフリーズするまで待ちます。この後、ブロックホルダーをオブジェクトホルダーに入れ、所定の位置に締めます。
ブレードの位置を調整し、ブロックを15マイクロメートルの切削増分でトリミングして、サンプルを覆うOCTを取り除きます。クライオスタットを調整して8マイクロメートルのセクションを生成し、廃棄される2〜3つのクライオセクションをカットします。ブロックに粘着フィルムを置き、フィルムをブロックに付着させるためにフィッティングツールを使用します。
さて、フィルムによってセクションを保持しながら、ゆっくりと一定の速度でカットを行います。サンプルの解凍を避けるために、クライオスタット内のクライオバーの上にあらかじめ冷却されたガラススライドの上にサンプルを上に向けてフィルムを置きます。テープを使用してフィルムをガラススライドに固定し、染色を容易にします。
ヒュームフードで、テキストプロトコルで概説されているように、エタノール、RNaseフリー水、および氷上のキシレンの必要な溶液を準備します。95%エタノールで30秒間インキュベートする。その後、RNaseフリーの水のセクションを慎重に30秒間浸してOCTを完全に取り除きます。
次に、50マイクロリットルの市販LCM凍結セクション染色をセクションに分配し、室温で10秒間インキュベートします。スライドの端を吸収性のティッシュペーパーの上に置いて、セクションを排水します。100%エタノールで30秒間リンスし、余分な汚れを取り除きます。
100%エタノールを含む第2のチューブに骨切片を30秒間浸し、30秒間100%キシレンに移します。粘着フィルムを支材としてドライガラススライドに貼り付け、できるだけ平らにしてください。この後、フィルム上にPET膜フレームスライドを置き、フィルムに取り付けるために膜上に手袋をした指を短く押します。
このサンプルは、膜と粘着膜の間に挟まれる。接着フィルムは折り畳んだりしわを入れたりしてはならないし、膜と膜の間に気泡があってはならない。表面デコン剤を使用してステージエンドキャップホルダーを清掃します。
スライドをスライドホルダーに、キャップをキャップホルダーに取り付けます。次に、フォーカスを調整し、1.25xの目的でスライドの概要を取得します。40xの目標に変更し、フォーカスを調整します。
スライドの概要を使用して、対象領域を選択します。次に、ここに示すようにレーザーパラメータを調整し、各目的に合わせてこれらのパラメータを最適化します。レーザーでサンプルのカットに失敗した場合は、レーザーパワーを上げます。
形態学的基準に基づいて、遠位大腿骨の概観または皮質骨の骨芽細胞、骨形成細胞、骨内皮細胞を選択します。ターゲットセルから遠ざかるようにレーザー経路の線を引き、UVレーザーによる損傷を最小限に抑えます。レーザーがサンプルを切断できない場合は、レーザーを複数回適用するか、不完全な切り傷のスポットのターゲットを検査し、移動と切断オプションを使用してこれらのスポットの組織を切断します。
各セルタイプを別々の0.5ミリリットルチューブキャップに集める。まず、βメルカプトエタノールを含む50マイクロリットルのリシスバッファーを回収管のキャップに分配する。キャップの中でサンプルを1分間上下にピペットしてライスします。
次に、ライセートをスピンダウンし、β-メルカプトエタノールを含むリシスバッファーの00マイクロリットルをチューブに加えます。各スライドに対して、βメルカプトエタノールを含む350マイクロリシスバッファーを用いた標識されたマイクロ遠心分離管を調製する。LCMの後に残っているセクションを使用してRNAを抽出します。
膜から膜を慎重に分離し、数回セクションにリシスバッファーをゆっくりとピペットすることによってサンプルを分解します。その後、ライセートサンプルをドライアイスに入れ、マイナス80度で保存します。続行する準備ができたら、室温でライセートを解凍します。
その後、コレクションチューブのLCM採取細胞から新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにライセートを移し、メーカーの指示に従ってRNAを抽出します。本研究では、マウス大腿骨の骨細胞における遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、LCMプロトコルが開発された。LCMは、サンプル収集に重力を使用するLCMシステムを使用して実行されます。
単離されたRNAの収率と完全性をマイクロキャピラリー電気泳動を用いて測定した。異なるライシスプロトコルを用いて得られるRNAの質と量の違いは、代表的なゲルおよびエレクトロフェログラムでここで見ることができます。試料をキャップ内で上下に1分間ピペットして分解すると、1平方ミリメートルのマイクロディセプトされた骨組織から約8.5ナノグラムのRNAを単離することが可能です。
RIN 値は 8.60 です。あるいは、LCMは、焦点が合っていないレーザーパルスを使用するLCMシステムを使用して実行され、材料を張り出した粘着キャップにカタパルトします。新鮮な凍結した骨の場合、マイクロディセクテッドされた骨組織の1平方ミリメートルから約1.6ナノグラムのRNAを単離することが可能です。
RIN 値は 1 です。結論として、この手順で覚えておくべき最も重要なことは、正しい方法で立っているプロトコルを適用し、サンドイッチ複合体内のセクションの完全な乾燥を防ぎ、適切なLCMシステムを使用し、細胞を収穫するための時間制限を超えないことです。捕獲された細胞からRNAを単離したら、RNAシークなどによって発現プロファイリングにRNAを使用できます。
最後に、キシレンとβ-メルカプトエタノールはフードの下で取り扱う必要がある有害物質であることを思い出させてください。また、液体窒素やクライオトームブレードの取り扱いには適切な注意をしてください。
