このプロトコルでは、単一の密度勾配を使用する必要があり、より複雑な従来の小地分離方法に比べて、労働集約性が大幅に低く、コスト効率が高くなります。このプロトコルの主な利点は、酵素が膵臓に直接送達され、組織消化が強化され、膵島の収量が増加することです。まず、マウスの手足をサギン位置にテーピングし、70%エタノールで体をスプレーします。
カバーグラス鉗子と湾曲した外科用ハサミを使用して、約3センチメートルの水平腹部皮膚切開を行い、皮膚を引き開いて腹壁を露出させます。腹部腹膜を3~4センチ垂直に切開し、膵臓を完全に露出させ、マウスを解剖顕微鏡の下に置きます。肝臓葉を優越に押して、淡いピンクのチューブとして現れる胆管を露出させ、右の腰部と腸骨領域から腹腔の右側に腸を静かに移動させ、胆管および肝動脈を露出させる。
シュワルツのマイクロサーリファインを使用して、肝臓にできるだけ近い共通の胆管を慎重にクランプし、十二指腸乳頭に位置し、膵管と共通胆管の組合によって形成されたVaterのアンペアを識別します。マイクロAdson鉗子を使用して、教えられた一般的な胆管を引っ張り、3ミリリットルのコラゲラーゼP溶液を含む3ミリリットルの注射器に取り付けられた30ゲージの半インチ針をVaterのアンプラに挿入し、針を血管に平行に押し込み、血管の約4分の1の長さで針を容器に平行に押し込みます。針が所定の位置に入ると、マイクロAdson鉗子で針を安定させ、ゆっくりと着実に3ミリリットルのコラゲターゼP溶液をダクトに注入します。
膵臓の頭、首、体、尾部が完全に膨張した場合、注射は成功したと考えられます。アンペアへの適切なエントリと共通胆管のカヌレーションは、成功した消化の収穫のために重要です。管壁を貫通すると、分離の効力が低下します。
湾曲した、マイクロのAdson鉗子を使用して、慎重に脾臓から始まり、胃に向かって、十二指腸に沿って続く膨張した膵臓を引き出す。その後、3ミリリットルの氷冷コラゲナーゼP溶液を含む50ミリリットルの消化管に膵臓を入れます。小島を収穫するには、最初に細かい外科用ハサミを使って膵臓を3〜5秒間切ってから、チューブを1分あたり100〜120回転で37度の水浴に入れます。
インキュベーションの終わりに、チューブを約30秒間軽く振って、溶液が細かい砂様膵臓組織粒子によって確認されるように均質になるまで組織を破壊する。組織が消化されるとすぐに、氷の上にチューブを置き、酵素反応を終了するために氷冷停止溶液の40ミリリットルを追加します。ペレットを穏やかに破壊した後、スイングバケット遠心分離機で消化された組織をスピンダウンし、続いて20ミリリットルの新鮮な停止溶液を洗浄ごとに2回の遠心分離します。
最後の洗浄後、氷冷HBSSの40ミリリットルでペレットを3回の追加洗浄のために再懸濁し、最後の洗浄後にペレットを5ミリリットルの室温密度勾配溶液に再懸濁させる。溶液が均質化されるまで、チューブを短時間低速で渦液してから、さらに5ミリリットルの室温密度勾配をチューブに加えます。10ミリリットルのピペットを使用して、10ミリリットルの室温HBSSを滴下的にチューブにゆっくりと加えて、勾配の形成を可能にし、スイングバケット遠心分離機を使用して密度勾配分離によって細胞集団を分離するようになりました。
遠心分離の終わりに、冷たいHBSSで10ミリリットルのピペットをプリウェットして、密度勾配とHBSSの間の小地層の5〜10ミリリットルを収集します。新鮮な氷冷HBSSの20ミリリットルを含む新しい50ミリリットルチューブに小島を移し、スイングバケツ遠心分離機で遠心分離によって細胞を収集します。慎重にペレットを乱すことなく上清の最後の3ミリリットルを除くすべてを吸引し、洗浄ごとに新鮮なHBSSの20ミリリットルで少なくとも3回島を洗います。
最後の洗浄後、上清を37°CRMPI 1640培地の4ミリリットルに交換し、チューブをそっと旋回させてペレットを取り除きます。すぐに100ミリメートルペトリ皿に小島を注ぎ、他の小島と洗浄をプール残りの小島を収集するために新鮮なRPMI 1640培地の5ミリリットルでチューブを洗浄します。その後、解剖顕微鏡と20マイクロリットルピペットチップを使用して、ペトリ皿から滑らかな表面を持つ健康な球状または楕円形の黄金色の茶色の小島を選び、完全なRPMI 1640培地の10ミリリットルを含む新しいペトリ皿に移します。
すべての小島が採取されたら、無菌インキュベーターに37°C、加湿空気中の5%の二酸化炭素を一晩で入れます。良好な健康な島は滑らかな丸い形状をしているように見えますが、損傷した悪い小島は粗いエッジを示します。未消化の外分泌組織は外観が半透明で、不規則な形状を示す。
コラゲナーゼP酵素の適切なカヌル化および分布は、膵臓の脾臓部分の膨張によって確認することができる。低グルコース培地中の一晩のインキュベーションは、翌日にグルコース刺激インスリン分泌アッセイのための小島をプライムすることができ、小島のインスリン分泌能力に関する洞察を可能にする。
