This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

注：実験は、実験動物の管理と使用に関するカナダのガイドに従って行ったとラヴァル大学動物保護委員会によって承認された。 1.サンプルの調製注：この例では、生後1日目のマウスの脳を使用していました。 <ol><li>その後氷冷L15培地中で可能な限り迅速に脳を解剖、子犬のために3から4分間砕いた氷に低体温麻酔を使用してください。 2分以内に、この手順を実行します。 </li><li>転送は、金型（物資のCF。リスト）を埋め込 ​​んで脳を解剖し、凍結組織包埋媒体が所望の位置に試料を方向付けるように注意しながらで埋める。 -80℃で液体窒素や店舗ですぐに標本をフリーズします。 30秒以内に、この手順を実行します。 注：試料は、RNAの品質を損なうことなく、数ヶ月保存することができる。 </li></ol> 2.セクショニング<ol><li>メンブレンCOAトリートテッドガラススライド（CF素材のリスト）表面アーゼ除染液とは、RNアーゼの痕跡を除去する。 DEPC水でスライドを洗浄し、それらを乾燥させます。代わりに、一晩200℃で焼くスライド。 </li><li>以前に、表面のRNAse除染液で洗浄するクライオスタットで凍結サンプルを転送します。 10μmの厚さでCとスライス標本を-20℃でクライオスタットチャンバ温度を設定します。膜コーティングしたスライド上の組織切片を収集し、染色の前にそれらを乾燥10分ましょう。また、ストアは、染色まで-80℃でスライドする。 </li></ol>染色溶液の調製<ol><li>単に実験の開始前に、すべての溶液を調製し、RNAの分解を防ぐために（洗浄液を除く）すべての染色溶液中のRNアーゼ阻害剤を使用する。 </li><li>緩衝溶液を準備します。 、すべての溶液に、同じ緩衝液を使用して（1％BSAを補充した成るRNアーゼを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）0.2％トリトンおよび2％のRNAse阻害剤）。各スライドのために、緩衝液400μlの（一次および二次抗体の200μlのための200μl）を用意する。 </li><li>固定液を準備し、70％エタノールを使用するには、-20℃で保存。 RNA抽出収率の大幅な低下を避けるために最小限の組織固定処置を続ける。 注：また、-20℃で保存し、5％酢酸を補充した95％エタノール溶液を使用。 </li><li>緩衝液中で一次抗体を希釈することによって一次抗体溶液を調製する。ドーパミン作動性ニューロンの標識のために、チロシンヒドロキシラーゼ（TH、ドーパミン産生のためのレート制限酵素）を標的とする抗体を使用しています。迅速なインキュベーション時間を補償するために、高濃度の抗体を使用する。 1:25希釈でTH抗体を使用してください。 注：1,000：通常の免疫蛍光プロトコルでは、この抗体は、1の希釈で一晩インキュベート強いシグナルを与える。このプロトコルでは、40倍以上concentrat使用されている短いインキュベーション時間のために編。このための方法に使用される高濃度の抗体を、非特異的標識化の増加を確認するために並行して、標準的な免疫染色​​を行う。 </li><li>緩衝液中で二次抗体を希釈することによって二次抗体溶液を調製する。 100：1の濃度のビオチン化二次抗体を使用してください。 注：この例では、抗ウサギビオチン化抗体を使用していました。 </li><li>ビオチン化二次抗体の検出のためのアビジン - ビオチン複合体（ABC）溶液を調製する。 1の濃度の化合物Aと化合物Bを添加することによってABC溶液を作製：DEPC PBSで希釈した100は、2％のRNAse阻害剤を補充した。スライドに追加する前に、アビジン - ビオチン複合体の30分を準備します。 </li></ol> 4.染色<ol><li>すぐに空気中にそれらをフリックで-80℃から一度に1つまたは2つのスライドを解凍（または送風機を使用してください）​​。疎水性とサラウンドのセクションバリアペンと、数秒間乾燥させます。 <ol><li> -20℃でわずか5分間冷たい固定剤溶液中にスライドを入れてください。すぐに洗浄にDEPC PBS 6-8回スライドを浸し、その後固定液の過剰を削除するには、一度空気中の振る。 </li><li> DEPC PBSの過剰を削除するスライドをフリック。ステップを解凍スライドが5分を超えていないことを確認してください。 </li></ol></li><li>クリーントレイに置きスライド（表面リボヌクレアーゼ除染液で前処理をRNアーゼの痕跡を除去するため）、室温で10分間、各スライド（ウサギ抗TH）に一次抗体溶液200μlを入れた。ディップは、洗浄のためにDEPC PBS中ですばやく3回スライドし、DEPC PBSの過剰を削除するには、一度スライドをフリック。 </li><li>室温で6分間各スライド上の二次抗体溶液200μlを入れてください。ディップはすぐに洗浄のためのDEPC PBS中で3回スライドし、DEPC PBSの過剰を削除するスライドをフリック。 </li><li> ABCソル200μlのを入れて室温で4分間各スライド上る。ディップは、洗浄のためにDEPC PBS中ですばやく3回スライドし、過剰DEPC PBSを除去するためのスライドをフリック。 </li><li> DAB（3,3 &#39;ジアミノベンジジン）ABC溶液中でのインキュベーションの4分の間に溶液を準備します。キット（DABペルオキシダーゼ基質キット）で提供される試薬を使用してください。提供される緩衝液の1滴、DAB溶液を1滴及びDEPC水2.5ミリリットルの30％H 2 O 2の1滴を混合する。反転させた溶液を混合。 </li><li> DAB溶液の196μLを取り、ちょうどスライドに拡散前のRNアーゼ阻害剤溶液4μlの（2％）を追加します。置きスライド（表面リボヌクレアーゼ除染液で前処理）クリーントレイに、スライド上のDAB溶液200μlを入れた。 注：DAB溶液は以内に1または2分を反応させる必要があります。 </li><li>ディップは、洗浄のためにDEPC PBS中ですばやく3回スライドし、無水エタノールで数秒間スライドを置く。空気中にそれらをフリックでスライドを乾燥（または送風機を使用してください）​​。&lt;BRの/&gt;注：スライドを将来の使用のために-80℃で保存またはLCMのために処理することができる。 </li></ol> 5.レーザーキャプチャーマイクロダイセクション<ol><li>空気中にそれらをフリックですばやくスライドを解凍（または送風機を使用してください）​​。ステップを解凍スライドが5分を超えていないことを確認してください。 </li><li> LCMに進んでください。捕集管キャップに直面して試料側で顕微鏡下でスライドを置きます。サンプルのための最高の倍率を選択してください。目的の細胞を見てピントを調整します。 <ol><li>切削領域を定義し、レーザーで切断開始。 （RNA抽出キットから）の溶解緩衝液50μlで満たされた捕集管キャップで解剖細胞または組織片を収集します。 LCMのステップが30分を超えていないことを確認してください。 </li></ol></li><li> RNA抽出キット（CF。材料のリスト）を用いて単離した細胞から全RNAを抽出します。製造業者のプロトコルに従ってください。 <ol><li> 42℃で30分間に収集された細胞をインキュベート細胞を溶解。コンディショニングバッファー250μLを添加することにより、RNA精製カラムを事前調整する。ロード溶解細胞にエタノールを50μlの。前処理精製カラムに溶解した細胞を100μlをロードします。 </li><li>室温で2分間16000×gでカラムを遠心。洗浄バッファーで二回カラムを洗浄。 RNaseフリー水の最小限の推奨容量（11μL）（それはバイオアナライザーを妨げる可能性として扱わDEPCではない）で溶出する。テスト品質に2μLにしてください。 注：すべてのソリューションおよび試薬キットで提供されている。 </li></ol></li></ol> 6. cDNA合成および定量的RT-PCR <ol><li>レーザーからの逆転写RNAサンプルを逆転写酵素およびオリゴ（dT）を用いて相補DNAにドーパミン作動性細胞を捕獲した。製造業者のプロトコル（CF。材料のリスト）に従ってください。 </li><li>遺伝子特異的プライマーを用いて定量RT-PCR増幅のためのcDNA1μlのを使用してください。 PCR REAを設定定量的PCRのための一成分ホットスタート反応ミックス20μlの容量中ctions製造業者によって推奨される。三重で各反応を行う。 <ol><li>ここに記載した実験のために、以下のプライマー対を使用します。GAPDH-F（5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;）/ GAPDH-R（5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;）; RPL13A-F（5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;）/ RPL13A-R（5&#39;-CTG C​​CT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;）;のTh-F（5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;）/ TH-R（5&#39;-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;）; AADC-F（5&#39;-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 &#39;）/ AADC-R（5&#39;- GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3&#39;）。 </li></ol></li><li>次の急速サイクリングパラメータを用いた定量的RT-PCR増幅を行う：95℃10秒95℃、60℃で10秒、72℃で10秒を45サイクル、続いて5分間。 determiする機器のデフォルト設定を使用して、融解曲線分析を実行NE均質産物形成。 </li><li>組み込みソフトウェアを使用してデータを分析する。 <ol><li>先に説明したように14の相対的な発現レベルを得るために、2つの参照遺伝子GAPDHおよびRPL13Aの発現DAマーカー遺伝子ThおよびAADCの発現値を正規化。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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著者らは、開示することは何もない。

この方法の最も重要な点は、RNAの分解を防止しながら、目的の細胞を標識することにある。 RNA分解酵素は、水溶液中でアクティブであるため、インキュベーション時間を減少させることは、RNAの保全11,15を向上させます。使用されるすべてのソリューションは、RNアーゼを不活性化するDEPCで処理しなければならない。全ての材料及び表面がRNアーゼ汚染を防ぐための表面のRNAse汚染除?...

脳は、複雑なネットワークを形成する異なるニューロンタイプの多種多様で構成されている。これらのニューロンは、それらの形態、接続性と遺伝子発現パターン1に係る個別のグループおよびサブグループに編成されています。マイクロアレイ、次世代シーケンシング、および定量RT-PCRの開発は、異なる生物学的状況1,2におけるニューロン集団の遺伝子発現プロファイルを比較するための可能性を提供する。 RNAの完全性を維持しながら、2-4これらの高感度分析は、目的の細胞型の正確な同定および単離を必要とする。蛍光活性化セルソーティング（FACS）技術が広く細胞表面マーカーおよび/または形態学に基づいて、特定の細胞型を単離するために使用されている。 FACSは、空間分解能5の完全な損失をもたらすソーティング前の細胞解離段階を必要とします。多くのニューロンの亜集団は、目での解剖学的分布に応じて互いに区別さEの脳。薄い脳切片に適用レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、高空間分解能6-8での細胞の特定の分離のための適切なオプションを提供します。 LCMの主な制限は、形態学的基準または遺伝的動物モデルで操作蛍光タンパク質レポーターに基づいて目的の細胞を同定するために必要であった。 LCMと組み合わせて、RNAの完全性を保存クイック免疫標識法を行うための新しい技術の開発が、現在、遺伝子プロファイリング実験を続行する細胞亜集団の単離を可能にする。 このアプローチは、以前に実行され、簡単に、いくつかの刊行物1,9-13に記載されている。ここでは、LCMを迅速免疫標識を組み合わせることによって、複雑な組織構造内の細胞の特定のサブセットから高品質のRNAを得るための詳細な手順を示す。我々は、最大のRNA回収率を得るために重要な重要なステップを実行し、sigができるように、RNAの分解を回避する方法を示してnificantly遺伝子発現プロファイリングに影響を与える。 このプロトコルのデモンストレーションのために、1日齢のマウスの脳からドーパミン作動性ニューロンが標的とされた。ドーパミン作動性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、ドーパミン合成の律速酵素に対する抗体を用いて免疫標識することができる。 TH免疫染色に続いて、ドーパミン作動性ニューロンの個人またはグループは、その後LCMを用いて単離することができる。顕微解剖した細胞を、溶解緩衝液中に収集され、そしてRNAは、RNA単離キットを用いて抽出した。品質と抽出されたRNAの量は、バイオアナライザー5を使用して測定される。用いた遺伝子発現のさらなる分析：RNA配列決定、マイクロアレイ、または定量RT-PCRは、続いて2,4,6-を行うことができる。一例として、二段階のqRT-PCRは、単離されたドーパミン作動性ドメインを捕捉し、レーザーで実証されている。 2ドーパミン作動性ニューロンのマーカー遺伝子の発現レベルの相対的定量化は、このプロトコルの選択性を示している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、高空間分解能を有する薄い組織切片から特定の細胞の単離を可能にする。効果的なLCMは、異種の組織からの細胞の亜集団の正確な同定を必要とします。 LCMのための目的の細胞の同定は、通常、形態学的基準や蛍光タンパク質レポーターに基づいています。 LCMおよび迅速な免疫標識の組み合わせは、特定の細胞型を視覚化し、周囲の組織から隔離するための代替的かつ効率的な手段を提供する。高品質RNAは、その後、純粋な細胞集団から抽出し、さらにRNA配列決定、マイクロアレイまたは定量RT-PCRなどの下流の適用のために処理することができる。このアプローチは、以前に実行され、簡単に、いくつかの刊行物に記載されている。この記事の目的は、RNAの完全性を維持しながら、細胞集団の迅速な免疫標識を実行する方法を説明するために、どのようにLCMを用いて、これらの特定の細胞を単離することである。ここで、我々は説明するdは、この多段階手順1日齢マウスからの脳組織におけるドーパミン作動性細胞の免疫標識および捕捉することができる。我々は、特別な配慮に値する重要な重要なステップを強調表示します。このプロトコルは、目的の組織および種々の細胞に適合させることができる。異分野の研究者らは、おそらくこのアプローチのデモの恩恵を受ける。

RNAの完全性を維持しながら、この迅速な免疫標識手順は、目的の細胞の可視化を可能にする。 図1は、RNA抽出前に組織調製のステップを示している。凍結切片の後、ドーパミン作動性ニューロンは、（ラベルニューロンが茶色で表示されます）チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を用いて標識される。実験的な質問に依存、単一細胞または関心の大きい領域は、LCM（ - ...

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

特定の組織中の細胞のサブセットの遺伝子発現解析は、主要な課題である。この記事では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで迅速な免疫標識法を組み合わせることにより、特定の細胞集団から高品質のトータルRNAを分離する方法について説明します。

迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K ビュー.  Université Laval. 特定の組織中の細胞のサブセットの遺伝子発現解析は、主要な課題である。この記事では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで迅速な免疫標識法を組み合わせることにより、特定の細胞集団から高品質のトータルRNAを分離する方法について説明します。 

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Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

哺乳動物の組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

生物学

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Bio - Rad社のTotal RNA Kitを使​​用してNeuroprecursor細胞からのRNA抽出

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

ステージ固有の半ばから後半のユーティリティ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵胞の分離

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

マウス膵臓からのRNAの単離：リボヌクレアーゼが豊富な組織

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...