これは、ex vivo代謝研究のための一次マウス筋幹細胞の単離のためのプロトコルである。このプロトコルは、過去に試した他のプロトコルと比較して、幹細胞の人口がはるかに多くなります。そして重要なのは、これらの幹細胞をミオチューブに分化すると、通常の生理学を示し、概日リズムのようなものです。
この手順を初めて試すときは、すべての組織の外植が異なって見え、筋芽細胞の成長にばらつきがあるので、詳細なメモを取り、いくつかの画像を保存します。視覚的なデモンストレーションがなければ、正しいセルを分離しているかどうかを知ることは困難です。私たちは、私たちの研究室でそれを確立したときに私たちにこの方法を示した他の人の寛大な助けの恩恵を受けました。
原稿による解剖用の皿を準備した後、2枚から3枚の厚い吸収紙をビニール袋に入れて湿ったチャンバーを準備し、ピペットを使って紙の表面を滅菌水で濡らします。チャンバーをUV光の下に5分間置き、殺菌します。4~8週齢のマウスから所望の筋肉を解剖し、1ミリリットルのゲンタマイシン当たり40マイクログラムを含むPBSで穏やかに洗いすんで殺菌する。
無菌鉗子を使用して、無菌10センチメートルの非コーティングされたペトリ皿に筋肉を移します。組織が湿っているが浮遊しないように、筋肉の上に0.5〜1ミリリットルのメッキ媒体を加えます。滅菌メスやカミソリの刃を使用して、筋肉を小さな断片に優しくスライスします。
鉗子またはピペットを使用して、あらかじめコーティングされた6センチメートルプレートの表面に筋肉の断片を移します。非常に穏やかに組織の上にメッキ媒体の追加の0.8ミリリットルをオーバーレイ。湿った部屋の中に筋肉の破片を含む6センチメートルの皿を置き、摂氏37度でインキュベーターに戻し、48時間二酸化炭素を5%戻します。
ミオブラスト培地、トリプシン、PBS-ゲンタマイシンを摂氏37度の水浴で準備して予感させます。各筋肉群にT25フラスコをコーティングするには、フラスコの表面に2ミリリットルのコーティング溶液を加え、穏やかに振って表面に均一なコートを作り、フラスコを摂氏4度で1時間インキュベートします。ピペットで、筋外植からメッキ培地を取り除き、PBS-ゲンタマイシンの2ミリリットルで筋肉の外植を穏やかに洗いす。
PBSを素早く取り出し、プレートをPBSに入れないでください。その後、PBS-ゲンタマイシンを1ミリリットル軽く加え、プレートを37°Cインキュベーターに1分間入れる。P1000ピペットを使用して、細胞を含むPBSを15ミリリットルの遠心分離管に集めます。
次に、プレートに1ミリリットルのトリプシンを加え、37°Cインキュベーターに3分間戻します。プレートを軽くタップして、筋芽細胞を取り除きます。細胞とトリプシンを収集し、PBSコレクションと組み合わせます。
遠心管に8ミリリットルの筋芽細胞培地を加え、そっと反転して混ぜます。2ミリリットルのメッキ溶液を筋肉プレートにそっと重ね、プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻します。遠心分離機中の細胞を含む遠心管を200倍gで3分間回転させます。
上清を吸引し、チューブに約1ミリリットルを保持します。ミオブラスト培地を静かに加え、細胞をあらかじめコーティングされたフラスコに移し、フラスコを37°Cのインキュベーターに入れる。P0筋芽T25フラスコからメディアを吸引する。
2ミリリットルの温かいPBS-ゲンタマイシンで細胞を短時間洗い上げ、フラスコからPBSを吸引する。ミオブラテを含む各フラスコに2ミリリットルの温かいPBSをピペットします。PBSと一緒にフラスコを37°Cのインキュベーターに3分間入れます。
次に、フラスコの側面をしっかりとタップして細胞を外します。軽い顕微鏡で、自由に浮遊する筋芽細胞を確認してください。フラスコを組織培養フードに直立させ、フラスコの底を10ミリリットルの筋芽細胞培地で2~3回すすいで、すべての細胞が外れ出すことを確認します。
15ミリリットルの遠心分離管に細胞培地混合物を集める。200回gで3分間遠心分離機。培地を吸引し、細胞ペレットを避けるように注意してチューブに1ミリリットル程度放置する。
遠心管に適切な量の筋芽細胞培地をそっと加え、軽く混ぜます。新しいT75フラスコに細胞混合物をそれぞれ6ミリリットルに分配する。新しいT75フラスコに10ミリリットルの筋芽細胞培地を加えます。
フラスコを水平方向に軽く振って細胞を分配し、一晩摂氏37度でインキュベーターに入れます。このプロトコルでは、外植から出現した初等細胞を標準の光顕微鏡下で観察した。筋芽細胞の初期の収穫は、小さな丸くて明るい球として現れました。
筋芽細胞の分化には4~6日かかり、細胞の形態は単一の丸い球から細長い融合された長い多核繊維に変化した。完全に区別されたミオチューブは、酸素消費率の測定の準備ができていた生成された。これらのセルは、いくつかのダウンストリーム アプリケーションに使用できます。
例えば、シーホースの機器の基質フラックスを研究するために頻繁に使用します。
