Name: preparation and culture of myogenic precursor cells/primary myoblasts from skeletal muscle of adult and aged humans
Uploaded: 2017-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
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This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC - Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.

本明細書に記載されたヒト組織を含むすべての実験は、リバプールの大学、大学病院エイントリー病院と南西ウェールズ研究倫理委員会によって事前に承認されなかった（承認番号：13 / WA / 0374）及び実験はグッドプラクティスガイダンスに従って実施しました。倫理は、この研究のためにスポンサーとしてリバプール大学は行動しました。すべてのドナーは、この研究の登録のためのインフォームドコンセントを与えています。筋肉が人から単離した（BMI &lt;25）：大人：30±2.8歳と高齢者：69±5歳。 文化1.準備<ol><li> ラミニンで培養表面のコーティング <ol><li> 1×DPBS（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）中のラミニンを10μg/ mLのの作業溶液を調製します。 </li><li>細胞はメッキしようとしているその上に表面を完全に覆うようにラミニン溶液の最小量（ 表1）をピペット。トンをインキュベート細胞をプレーティングする前に、加湿した37°Cでの彼の培養皿に少なくとも30分間、5％CO 2インキュベーター。渦の使用を回避すること、慎重にラミニンを扱います。 DPBS中で希釈は10μg/ mLのラミニンの作業溶液を数回、4℃で保存し、再利用することができます。 </li><li> 6ウェルプレート中で60ミリ（20 cm 2）をペトリ皿または2つのウェルを使用して（2×10センチメートル2）〜18ごと-骨格筋の19 mgの細胞（合計5.50×10 4細胞）をプレートに。機能的研究のための細胞をプレーティングするときに、すべての回で細胞計数を行います。 注：サンプルは、もともと女性患者（30±2.8歳、高齢者：69±5歳、BMI &lt;25成人）の足の手術（指伸筋・ブレビス、前脛骨または外転halluces筋）から得ました。 </li></ol></li><li> 酵素溶液の調製 <ol><li> 10 mLの1×DPBSの株式のCaCl 2の277 mgを250 mMの塩化カルシウム2作業溶液を準備します。そうフィルター4℃で0.2μmのフィルター膜とストアとリューション。 </li><li>コラゲナーゼDの1.5 U / mLで、ディスパーゼIIの2.4 U / mLおよび無血清DMEM中の2.5mMのCaCl 2（ダルベッコ改変イーグル培地）（ 表2）の作業溶液を調製します。 </li><li>よく混ぜ、滅菌用0.2μmのフィルター膜を介して酵素液をフィルタリングします。事前に酵素液を調製し、ダウン凍結（-20°C）将来の使用のためにアリコートインチ</li></ol></li></ol> 2.組織消化：機械および酵素的解離<ol><li>サンプル収集に続いて、消化するまでDPBSで4℃で筋肉を維持します。 18あたりのコラゲナーゼディスパーゼ-のCaCl 2溶液2mLの最小体積準備-筋肉組織の19 mgのと組織解離の前に37℃に温めます。 </li><li> 70％エタノールで簡単に筋生検を浸し、新鮮なDPBSで洗浄し、酵素の1 mLで新しいペトリ皿に組織を置きます溶液。 </li><li>できるだけ多くの線維化および脂肪組織を捨て、滅菌はさみまたは外科用メス（ブレード番号10）で（約&gt; 0.5ミリメートル2）小さいが識別可能なピースに素早くしかし穏やかに筋肉を引き裂きます。 </li><li>コラゲナーゼディスパーゼ-のCaCl 2の残りの1 mLで50 mLチューブに試料を移します。 </li><li> 40分 - 30まで37℃で組織をインキュベートします。 10分 - 優しくチューブごと5を攪拌することにより、筋肉組織を移動します。 </li><li>コートメディアでピペットがピペットのプラスチック壁に放出された細胞の付着を回避します。消化を停止するために、例えば 、滅菌増殖培地2容量、DMEM、20％FBS（ウシ胎児血清）、1％L-グルタミンおよび1％P / S（ペニシリン-ストレプトマイシン）を4mLを加えます。 </li><li>筋線維からの細胞の放出を助けるために5 mLのピペットで上下にピペットで数回。 注：サンプルは、通常、完全に、その小さなサイズに解離されます。 However、筋肉の断片がまだ残っている場合、筋肉の残りの部分で、新鮮な酵素溶液と第二のインキュベーションを使用します。 </li><li> 50 mLのコニカルチューブの上に70μmのセルストレーナーを介して筋肉のソリューションをフィルタリングします。ストレーナーを通して多くのメディアやフィルタを持つ残りの細胞を洗浄。 </li><li>細胞をペレットに室温で5分間、443×gで遠心分離します。慎重に上清を捨てます。 </li><li> F-12培地（HamのF-12栄養素混合）、20％FBS、10％HS（ウマ血清）、1％P / S、1％のα-グルタミン及び2.5 ngのFGF-B / mLの（にペレットを溶解します組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子）。ここでは、60ミリメートルのペトリ皿当たり培地4mLのを使用しています。 </li></ol>細胞の3播種<ol><li>以前インキュベーター（セクション1.1）からの10μg/ mLのラミニンでコーティングされた培養容器を収集します。 </li><li>慎重に培養皿からラミニンの過剰分を除去し、表面には触れないでください（または、それは、タンパク質の構造を妨害します）。ウォッシュ（オプション）DPBSで培養皿。 </li><li>ラミニンコートした容器に直接細胞をプレートし、加湿した37℃、5％CO 2インキュベーター中で24時間インキュベートします。 </li><li>明視野顕微鏡（100X総合倍率）次の日の下で細胞を可視化。丸小細胞が表面に付着し、残りの破片は、培養培地中に見ることができます。 </li><li> 20％FBS、10％HS、1％P / S、1％のα-グルタミンおよび2.5 ngのFGF-B / mLの補完新鮮なF-12培地にメディアを変更します。 </li></ol> 4.文化や細胞の継代<ol><li> 3 dおよび自発的な回避するために、細胞のグループが（7日後に、100X総合倍率、 図2の例では、高齢者からの細胞を、継代0）顕微鏡下で可視になるとすぐに細胞を分割-メディアごとに2を変更分化。 </li><li>第一通路（P1）で、20％FBS、10％HSで補完高グルコースDMEM、1％の培地を変更P / S、1％のα-グルタミン。 FGFは、培養開始時強力なマイトジェンおよび重要な要因であるとして、この点から、FGF-Bを使用しないでください、しかし、文化の中で長く使用されている場合には、線維芽細胞の異常増殖を促進することができます。 </li><li>細胞継代の場合： <ol><li>メディアを取り外し、DPBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li>細胞の表面を覆うように0.25％EDTA-トリプシンの最小容積を追加します。室温で10秒間インキュベートし、全ての細胞が剥離液で覆われていることを確認するために優しくロ​​ックし、それを削除します。 </li><li> 5分-加湿37°C、3、5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートします。優しくタップすると、細胞が丸みを帯びたが、表面から完全に切り離されていないことを明るい光顕微鏡（100X総合倍率）の下で確認してください。変化は、細胞中で観察されていない場合は、さらに5分間インキュベートします。 </li><li>ミックス、細胞を収集するために、成長培地5mLの（20％FBSで補完高グルコースDMEM、10％HS、1％P / S、1％のα-グルタミン）を追加ウェルおよびT75フラスコに新しいメディアで細胞を移します。残りの細胞は増殖培地の別の5mLの（1 T75フラスコの合計で10 mL）で、このステップを繰り返し洗います。 </li><li> （第一通路で望ましい）preplateするには、加湿37℃、40分間、5％CO 2インキュベーターで細胞をインキュベートします。新しいT75フラスコにそれらを添付して、インキュベートしなかった細胞と上清を収集します。線維芽細胞のほとんどは最初のフラスコに取り付けられているはずですので、これは、筋芽細胞に文化を豊かにする必要があります。 </li></ol></li><li> 3 dおよびそれらが最大収率70％コンフルエントに達するとすぐ4にセル1を分割する - メディアごとに2を変更します。 </li><li>細胞が70に達したら分化のために、 - 80％の密集度を、分化培地（DM）に培地を変更し、2％HS、1％P / S、1％のα-グルタミンで補完高グルコースDMEM。筋芽細胞cの品質と純度に応じて7日 - 細胞が5以内に区別されるべきですulture。 </li></ol> 5.トランスフェクションプロトコル<ol><li>シード50,000細胞/ウェルでMF 20、老化および生存度アッセイのために12ウェルプレート。カバースリップ上またはラミニンでコーティングしたシャーレで培養細胞。 Ki67染色のために、12ウェルプレート中/ウェル25,000細胞を播種します。 </li><li>トランスフェクションのために、トランスフェクション試薬の5μLを使用して、製造元の手順に従って、制御マイクロRNAの100 nMのは、1 mLの総容量で、ウェル当たり阻害剤を模倣するマイクロRNAまたはマイクロRNAの100nmの、100 nMのを模倣または阻害剤。 </li><li>トランスフェクション後の分化中6時間に変更します（高グルコースDMEMは2％HS、1％P / S、1％のα-グルタミンで補完します）。増殖実験のために、細胞をトランスフェクション後2日を染色します。老化のために、トランスフェクション後7日。そして、MF20染色のため、トランスフェクション後7日。 </li></ol>細胞の6.免疫染色<ol><li> Ki67を、のMyoDおよびMF 20免疫染色<ol><li>ブロック1（10を準備します％HS、0.1％PBS中のTriton-X）とPBS）溶液中の2（10％HSおよび0.05％のTriton-Xを遮断します。 12ウェルプレートのためにウェルあたり試薬500μLを使用してください。 注：インキュベーション工程のためにシェーカーを用いて、以下の手順を実行します。 </li><li>細胞から培地を除去。 </li><li> PBSで細胞を洗浄します。 </li><li>ロッカー上で10分間、冷メタノールで細胞を固定してください。 </li><li>細胞からメタノールを除去し、5分毎の時間のためにPBSで3回すすいでください。 </li><li>ブロック1溶液を加え、1時間室温でロッカー上で細胞を培養します。 </li><li>一次抗体溶液を追加します。Ki67染色のために、Ki67のにウサギモノクローナル抗体を使用して（1：ブロック2 1,000希釈）。 MyoDのために、MYOD1（D8G3）XPのウサギモノクローナル抗体を使用して（1：ブロックで100希釈2）。 MF 20染色のために、MYH1E（MF 20）の一次抗体（1：ブロック2 1,000希釈DSHB、1）を使用します。 </li><li>ロッカー上O / N（4℃）に1時間（RT）のための一次抗体で細胞をインキュベートします。 </li><li> STO場合、それは数回再使用することができる（一次抗体を集めます4℃で赤）。 </li><li>細胞はPBS、5分ずつで3倍すすいでください。 </li><li>適切な二次抗体を追加したKi67またはMyoDの染色を、ヤギ抗ウサギIgG（H + L）二次抗体のためアレクサフルオロ488コンジュゲート（1：PBS 1,000希釈）。 MF 20染色を、ヤギ抗マウスIgG（H + L）二次抗体、アレクサフルオロ488コンジュゲート（：PBS 1,000希釈1）のために。 </li><li>細胞を含有するプレートをラップし、RTでロッカーに暗所で2時間、二次抗体をインキュベートします。 </li><li>細胞を5分間PBSで各回3倍すすぎます。 </li><li>細胞にと5 RTでロッカーにインキュベート - 10分：DAPI溶液（PBS 1,000希釈1）を追加します。 </li><li>細胞を5分間PBSで各回3倍すすぎます。 </li><li>新鮮なPBSの1 mLを加え。 </li><li>マウントソリューションでカバースリップ上の細胞をマウントまたは蒸発を避けるために、パラフィルムでPBSで細胞を含むプレートをシール。 </li><li> 4℃で保存。 </li><li>で細胞を可視化蛍光顕微鏡できるだけ早く（遅くとも2週間）。 </li></ol></li><li> 生死判別試験 <ol><li>細胞から培地を除去。 </li><li> PBSで細胞を洗浄します。 </li><li>千エチジウムブロマイドと1：PBSで希釈した千アクリジンオレンジ1を追加します。 注意：注意してくださいし、健康と安全規制の範囲内で動作 - エチジウムブロマイドは発癌物質です。 </li><li>染色溶液中の細胞を含むプレートをラップし、5分間ロッカー上、室温でインキュベートします。 </li><li>蛍光顕微鏡で細胞の画像を撮影：アクリジンオレンジのためのグリーンチャンネル。臭化エチジウムのための赤チャンネル。 </li></ol></li></ol>

There is nothing to disclose.

ここでは、伸筋digitorium・ブレビス、前脛骨筋または外転halluces筋肉から成人および高齢のヒトから筋前駆細胞/一次筋芽細胞を単離する、シンプルな堅牢、安価で、再現性と効率的な方法を提示します。このプロトコルは、FACS-またはMACSソーティングなど、より洗練された方法は、実用可能かどうかではない場合は特に、成人および高齢のヒトからヒト一次筋芽細胞を用いた研究を可能にすることを目指しています。 この原稿で提示分離法は、約2時間かかります。筋肉の分離の間、筋肉は、汚染を避けるために70％エタノールで洗浄しました。筋肉の解離を酵素的に先立って、小さいが、可視片に筋肉を切断し、あまりにも多くのミンチからの細胞の損傷を避けることが重要です。筋線維の解離および衛星細胞および筋原性前駆細胞のリリースで消化結果。骨格筋の〜20ミリグラム、1 60ミリメートルのための私達の場合には（20 cm 2）をペトリ皿に細胞を回収するための最も適切な表面積でした。小さい表面上に播種した細胞は、細胞死の増加および凝集を示したのに対し、より大きな表面上に播種した細胞は、増殖が減少を示しました。 分離の際に、細胞を培養し、ラミニン被覆されたプレート上で増殖させました。非被覆表面を使用することは、分離の成功を減少させる傾向がありました。この理由のために、細胞は、好ましくは直接分離した後、予めコーティングされた表面上に収穫することができます。細胞を直接単離後、非被覆表面に収穫された場合の線維芽細胞富化培養物は、筋芽細胞由来の細胞ではなく、優勢になります。別にラミニンから、例えばマトリゲルおよびコラーゲンベースの試薬のような他の細胞接着溶液の使用を使用することができます。コーティング溶液は、細胞増殖を促進する成長因子および他の化合物を挙げることができるが、これらは、細胞の挙動、したがって、実験結果を変化させることができます。にそれは、任意の成長因子または他の相補体を欠いているように私たちの経験、を10μg/ mLのラミニンは、衛星細胞および筋芽細胞の付着および増殖のための最適な濃度および適切なコーティング試薬です。また、ラミニンは、直接骨格筋線維を介して衛星細胞の付着および遊走に重要な機能を果たしている筋細胞膜に結合された、基底膜中に天然に存在しています。 培養培地のサプリメントは、一次筋芽細胞の挙動に有害な影響を与える可能性があります。このようなのFGFまたはIGF類として、例えば成長因子群については、FGF-2は、分裂促進およびプログラム細胞死応答31の両方を制御することで、一次筋芽細胞培養物に対する多面的効果を有します。大人と高齢者の筋肉から単離した初代筋芽細胞の挙動の違いが原因で純度Oになる可能性が非常に高い、特にので、厳密に培養条件を制御することが必要です文化や長期培養35時の培養液中の筋芽細胞をオーバーラン線維芽細胞の可能性F。私たちは、線維芽細胞と培養液の汚染を低減するために、非コーティングされた表面上に第1分離の間に細胞の1時間前メッキを使用しています。 私たちが説明する方法は、成人および高齢者ヒトの両方の筋肉から筋原性前駆細胞を単離するための適切です。筋原細胞の高い割合によって示される（ 図1においてMF20免疫染色によって可視化のMyoD発現および筋形成特性および2）およびプロセスの機能的研究のためのin vitroモデルとして使用することができる単離された細胞は、細胞の代表的な筋原集団で構成され筋肉の恒常性に関連付けられています。 これまでの研究では、ヒト一次筋芽細胞の単離および特性の違い、またはその欠如、からを特徴としています成人および高齢者6、20、27、28、29、30、31、35、3 6、37、38。高齢者および/または非機能的なヒトのMPCの存在は、6、20、22に示されています。しかし、新たに単離されたヒトのMPCの挙動の差も27が示されていません。私たちのプロトコルは、高齢者の筋肉から単離した初代筋芽細胞の減少増殖能や老化などに少なくとも部分的にそれらの表現型を維持し、一次筋芽細胞の単離を可能にし、これらを使用することが可能になります22を老化時の筋肉の恒常性の分子機構の機能研究のための細胞。 ここに記載した方法を用いて単離された初代筋芽細胞は、筋原性分化研究のためのみならず、使用することができるだけでなく、老化の間のヒト筋原性前駆細胞に存在する遺伝子発現の変化のような細胞内の変化を調査します。しかし、長期のex vivoで培養中の細胞に生じる変化は、老化の間に生じる表現型と遺伝子型の変化を分析する際に考慮される必要があります。私たちは、この目的のために新たに単離した細胞を使用することをお勧めします。 また、ここで説明した一次筋芽細胞培養法は、堅牢なin vitroでの機能研究を可能にし、拡張およびヒト一次筋芽細胞の比較的長期培養を可能にします。我々は、以前に我々の方法を用いて単離した筋原性前駆細胞が発現プロファイリングおよびFUの両方に使用することができることを示しています筋肉の老化22に関連するプロセスのnctional研究。この方法はまた、成体の筋肉や古いげっ歯類に適用可能であり、高齢化と機能研究22の間に遺伝的およびエピジェネティックな変化をプロファイリングするために使用することができる筋芽細胞の濃縮された文化を単離することができます。この方法の制限は、細胞のある程度、混合集団ではなく、より洗練された公開された方法6、28、29、39、40、41、42を用いて得ることができる衛星細胞の純粋な集団の使用を含みます43。 私たちは、大人と高齢者からの一次筋芽細胞の細胞の単離のために、簡略化された手頃な価格で、かつ再現性のあるプロトコルを提示します人間。我々の経験では、（そのようなMACS-またはFACSソート衛星細胞など）ヒト一次筋芽細胞の単離および文化の利用可能な、より洗練された方法は、細胞中のトランスクリプトームやプロテオーム変化をプロファイリングなどの研究、いくつかの種類に最適です。しかし、これらの方法は、高価であり、専門知識の少なくともいくつかのレベルを必要とし、かつによる筋芽細胞を過剰成長純粋な一次筋芽細胞培養および線維芽細胞の低増殖率に難しいかもしれません。 私たちは、機能的研究で使用するためのヒト一次筋芽細胞の簡単な単離および培養を可能に再現可能なプロトコルを提示します。さらに、当社は、ラミニン42の使用と成功の文化44のための鍵となる要因としてbFGFの限られた使用を提案しています。我々はまた、細胞を分割し、第一通路45に1つのプレめっき工程時に遠心分離することにより発生する応力を回避することを提案します。要約すると、我々が持っていますまた、げっ歯類の筋肉に適用可能であり、表情や筋肉の恒常性の機能研究を可能にし、成人と高齢者のヒトの筋肉からの一次筋芽細胞/のMPCの単離および培養のための効率的なプロトコルを最適化しました。

疾病や虚弱で、骨格筋量および機能結果の年齢に関連した進行性の喪失、高齢者の生活の質の強度及び減少の減少。骨格筋は、約40％の体重1を占めます。脂肪及び線維症の浸潤に、個々の筋線維と筋品質の低下の進行性萎縮老化および疾患中1、2、3、4、5、6を生じます。 最近では、特にげっ歯類で発生すること筋繊維損失は、人間7で発生しないことがあり、骨格筋の老化における種特異的な違いが発生することが提案されています。それにもかかわらず、高齢者の哺乳動物の残りの筋繊維が損傷し、障害のある再生に感受性の増加によって特徴づけられます<supクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 8。 大人の筋肉の修復とメンテナンスが衛星細胞9、10によって媒介されます。筋損傷およびその他の関連する手がかりすると、衛星細胞が活性化し、増殖になります。細胞のサブセットは、静止状態に戻り、残りは筋芽細胞（筋原性前駆細胞 - のMPC）に進行します。これらは、既存の筋線維11の修復に貢献します。衛星細胞の機能は、筋肉再生の成功を決定し、加齢に伴う衛星細胞の利用可能性の変化は12、13、14、15に示されています。また、古いヒトおよび齧歯類の筋肉からの衛星細胞は、転写プロファイルスイッチを示し、再生能16,17を 低減 </sup&gt; 18、19。老齢マウスおよびヒトの筋肉衛星細胞は、それらの還元機能20をもたらす老化を受けることが示されています。 筋恒常性の研究を可能にする最も確立された細胞株は、マウスC2C12細胞ライン21です。研究のかなりの量はまた、マウスの一次筋芽細胞22を使用しています。これらの培養物は、マウスと脊椎動物の筋形成だけでなく、筋肉再生、筋管/筋線維の萎縮、および筋肉疾患の間に発生し、23、24、25、26を老化肥大プロセスの重要な理解につながっています。さらに最近では、いくつかのグループが筋形成と筋肉の老化を研究するためにヒト一次筋芽細胞を用いて説明しています。しかし、レガールとのコンセンサスが欠如しています成人および高齢のヒト27、28、29、30、31の筋肉から単離された一次筋芽細胞との間の差にDS。全身および局所環境は、老化や病気6、32、33、34、開発中に発生する特徴の違いにもかかわらず、in vitroでの筋芽細胞および筋管培養物は、筋肉の発達、成長および萎縮に関連する分子メカニズムを研究するための最もアクセスしやすいツールが残ります。さらに、これらの研究だけでなく、堅牢を提供するだけでなく、 インビトロツールは比較的、迅速、安価で高スループット。さらに、ヒトの筋肉の研究に関連した倫理的含意が機能的実験のために、遺伝子発現の操作を伴うことを意味します<em&gt;、in vitroでのヒト筋芽細胞および筋管培養物は、脊椎動物のモデル生物が利用可能な唯一の代替残ります。 ここでは、成人および高齢者の筋肉からの一次筋芽細胞、またはのMPCの、堅牢で安価、かつ再現性の分離のための簡単な実験プロトコルを、示し、in vitro培養（ 図1）の標準化された条件を説明します。筋肉からの初代培養物は、通常、筋芽細胞に加えて、線維芽細胞が含まれているように、我々は、一次筋芽細胞の純度が向上し、品質を目指しプレプレーティングステップをお勧めします。要約すると、我々は、効率的かつ再現性の分離、文化、大人や高齢者の骨格筋からの富化および機能のMPC /一次筋芽細胞の機能研究を可能にするプロトコルを確立しました。

<table><tbody><tr><td>60 mm Petri dishes</td><td>Greiner Bio One</td><td>628160</td><td>Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS.</td></tr><tr><td>Cell culture plates (6-well)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3516</td><td>Corning Costar cell culture plates. 6-well, flat bottom (Individually wrapped) .&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cell culture plates (12-well)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657 160</td><td>Cellstar Cell culture Multiwell Plates.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Culture flasks</td><td>Greiner Bio One</td><td>&amp;nbsp;690175 (25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;); 658175 (75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;).</td><td>Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks.</td></tr><tr><td>Standard Disposable Scalpel</td><td>Granton</td><td>91310</td><td>Sterile stainless steel blade, pattern: 10.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Greiner bio-one</td><td>606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)</td><td>Cellstar Serological Pipettes.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteur plastic pipettes</td><td>Starlab</td><td>E1414-0311</td><td>3.0 mL Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped.</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>300613</td><td>20 mL BD eccentric tip syringe.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m filters</td><td>Gilson</td><td>ALG422A</td><td>Sterile Syringe Filters CA 0.2 &amp;micro;m 33 mm Pk50.</td></tr><tr><td>Cell strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597522</td><td>Cell culture strainer sterile individually packed 70 &amp;micro;m polypropylene.</td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td>Collagenase D; Activity: &amp;ge;0.15 U/mg&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td>Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: &amp;ge;0.5 U/mg solid.</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td>Calcium chloride, anhydrous, beads, &amp;minus;10 mesh, &amp;ge;99.9% trace metals basis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9&amp;nbsp;</td><td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1 mg/mL.</td></tr><tr><td>DMEM-high glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium - high glucose. With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate.</td></tr><tr><td>F-12 media</td><td>Gibco</td><td>21765029</td><td>Ham&#039;s F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine.</td></tr><tr><td>FGF-b</td><td>PetroTech</td><td>100-18B&amp;nbsp;</td><td>Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Fetal Bovine Serum.</td></tr><tr><td>Horse serum (HS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1270</td><td>Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered.</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered.</td></tr><tr><td>TrypLE Express&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td>TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red.</td></tr><tr><td>DPBS (cell culture)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride.</td></tr><tr><td>PBS (immunostaining)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>Phosphate-buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4000/PC17</td><td>Methanol Analytical Reagent Grade</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 for molecular biology.</td></tr><tr><td>anti-MF 20 antibody</td><td>DSHB</td><td>MF20-c 2ea 211 &amp;micro;g/ml.</td><td>MYH1E (MF 20) Mouse mAb.</td></tr><tr><td>anti-MyoD antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13812P</td><td>MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.</td></tr><tr><td>anti-Ki67 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>Rabbit mAb to Ki67 [SP6].</td></tr><tr><td>Anti-mouse 488 secondary antibody&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 488 secondary antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td></tr><tr><td>Senescence &amp;beta;-Galactosidase Staining Kit</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9860</td><td>Senescence &amp;beta;-Galactosidase Staining kit.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41639</td><td>Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, &amp;ge;99.5% (GC).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acridine Orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8097</td><td>Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td></tr><tr><td>Scramble control for transfections</td><td>Qiagen</td><td>1027271</td><td>miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)</td></tr><tr><td>Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>218300</td><td>Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5&#039;-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor</td><td>Qiagen</td><td>219300</td><td>Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5&#039;-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Megafuge 2.0 R Centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>75003085</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Heraeus</td><td>3360</td><td>Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm.</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Inverted Microscope System</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Eyepieces: CFI 10X/22; Total magnification: 100X (MF20, Live/dead and Ki67).</td></tr><tr><td>Axiovert 200 inverted microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>n/a</td><td>Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Total magnification: 100X (Senescence &amp;beta;-Galactosidase Staining).</td></tr><tr><td>Axiovert 25 inverted microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>n/a</td><td>Eyepieces: E-PL 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).</td></tr><tr><td>Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Eyepiece: CFWN 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).</td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>Hydromount</td></tr></tbody></table>

preparation and culture of myogenic precursor cells/primary myoblasts from skeletal muscle of adult and aged humans

骨格筋の恒常性は、筋肉の成長（肥大）、萎縮と再生に依存します。老化の間、およびいくつかの疾患で、筋肉の消耗が発生します。筋肉量及び機能の喪失は、筋線維型萎縮、繊維型スイッチング、衛星細胞、筋肉幹細胞、および他の病態生理学的プロセスの機能不全に関連する欠陥筋再生に関連付けられています。これらの変化は、細胞内の変化だけでなく、局所的および全身のニッチと関連しています。倫理的な意味に筋肉の老化の最も一般的に使用されるげっ歯類モデルに加えて、筋肉のホメオスタシスおよびヒトモデルを使用して無駄を検討する必要があり、これは、主としてインビトロ培養物から成ります。人間の筋原性前駆細胞（MPCは）および筋形成における一次筋芽細胞の広範な使用にもかかわらず、加齢に関連したMUSの異なる側面を制御する分子メカニズムを研究するために、ヒト初代筋芽細胞および筋管培養を用いて上の限られたデータがあります老化のメカニズムの検証を助けるCLE消耗は、齧歯類の筋肉で提案されています。成人および高齢者から単離されたヒトのMPC、一次筋芽細胞および筋管の使用は、筋肉の成長、萎縮および再生に関連するプロセスの分子機構の生理学的に関連するモデルを提供します。ここでは詳細に人間のMPCとその子孫の単離および維持のため、堅牢で安価で、再現性と効率的なプロトコルを記述 - 酵素消化を用いて、ヒトの筋肉サンプルから筋芽細胞および筋管。さらに、我々は、成人および高齢者からの一次筋芽細胞は、 インビトロ培養で老化を起こすれる通過数を決定しました。最後に、我々はこれらの筋芽細胞およびそれらの増殖および分化能力を特徴付け、筋形成し、in vitroでの筋萎縮の分子機構の機能研究を行うための適性を提案する能力をトランスフェクトする能力を示します。 </p&gt;

MPC /一次筋芽細胞は、ラミニンでコーティングされた表面上に見える24時間後播種（ 図2）でなければなりません。細胞は紡錘状の形状を採用すべきであると通路4（ 図1A、B）にまだあるMyoDを表現しなければなりません。線維芽細胞は、それらの星状形態とのMyoD（ 図1B、C）の発現の欠如によって区別することができます。細胞は翌日に添付されると、メディアが新鮮なbFGFのメディアに置き換える必要があります。培地は48時間毎に交換する必要があります。 代表的な結果は、ここに示されていると私たちの分離と文化プロトコルをサポートし、ヒト一次筋芽細胞の機能的研究のために使用することができます異なる技術を実証するために、我々の研究室22目的のデータを公表しました。筋芽細胞の増殖はstaininを使用したKi67免疫染色と生存能力を使用して研究することができます細胞生存率アッセイのためにG（ 図3）。分化のために、培地を分化培地に変更されるべきです。筋管は5に形成すべきである- 7 dおよび（ 図3）重鎖正ミオシンします。筋芽細胞は、高齢者（ 図3）の筋肉から単離されたときに筋管形成はあまり効率的であることに注意してください。老化（SA-βガラクトシダーゼ）染色はまた、培養物中の老化細胞のパーセンテージを確立するために（ 図3）で行うことができます。私たちは、長い培養（ 図3、通路4）で、高齢者の筋肉から分離された複数の筋芽細胞が老化を示すことを観察しました。 機能的研究のために、遺伝子およびマイクロRNA発現は、発現ベクター、siRNAは、マイクロRNA模倣とantimiRs（ 図4）の親油性トランスフェクション試薬媒介送達を使用して操作することができます。これは、40を可能にします -遺伝子/マイクロRNAのレベルがアップされると、70％のトランスフェクション効率または生理学的範囲（ 図4; 22）内でダウンレギュレート。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 培養容器 </td><td> 約エリア（ウェルあたり） </td><td> 10μg/ mLのラミニンの巻 </td></tr><tr><td> 35mm皿</td><td> 10cm 2の</td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> 60ミリメートル皿</td><td> 20センチメートル2 </td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td> 100ミリメートルディッシュ</td><td> 60センチメートル2 </td><td> 4 mLの</td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td> 2 cm 2の</td><td> 200μL/ウェル</td></tr><tr><td> 12ウェルプレート</td><td> 4センチメートル2 </td><td> 500μL/ウェル</td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td> 10cm 2の</td><td> 1 mLの/ウェル</td></tr><tr><td> T25 </td><td> 25cm 2の</td><td> 3 mLの</td></tr><tr><td> T75 </td><td> 75cm 2の</td><td> 5 mLの</td></tr></tbody></table> 表1。 コーティング培養表面のためのラミニンDPBSソリューション（10μg/ mL）の推奨最小容量。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 具体的な活動/モル質量 </td><td> 最終濃度 </td><td> 10 mL溶液に必要な質量または体積 </td></tr><tr><td> コラゲナーゼD </td><td> 0.15 U / mgで</td><td> 10mg / mL（1.5 U / mL）を</td><td> 100 mgの</td></tr><tr><td> ディスパーゼII </td><td> 0.5 U / mgで</td><td> 4.8 mg / mlで（2.4 U / mL）を</td><td> 48 mgの</td></tr><tr><td> 250 mMのCaCl 2を </td><td> 1100.98グラム/モル</td><td> 2.5 mMの</td><td> 100μL </td></tr></tbody></table> 表マッスル消化2.酵素製剤。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig1.jpg" /> 議定書の手順をまとめると図1.グラフィカルアブストラクト。ハサミでまたは外科用メス（I）を有するヒト筋生検の解離。 40分（II） - 30、37℃で酵素液とのインキュベーション。増殖培地を添加し、遠心分離管（III）に70μmのメンブランフィルターを通して溶液を濾過を通じて消化の終了。 5分（IV）の場合は443×gで遠心分離します。上清を廃棄し、2.5 ngの/ mLのFGF（V）を含有する増殖培地中で再懸濁します。 10で被覆されたディッシュ上に細胞をプレーティング81;ラミニンのグラム/ mLおよび24時間（VI）の後にメディアを変更します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig2.jpg" /> 別の通路で成人と高齢人間の筋肉から分離され、図2筋芽細胞。 。 （69±5歳、BMI &lt;25大人：30±2.8歳、高齢者）イメージは女性患者の指伸筋・ブレビスから単離された筋芽細胞、前脛骨筋または外転halluces筋肉を表します。継代0時とめっきされるの5日後、細胞はまだラウンドと小さいが、明るい光顕微鏡（A）の下に見えます。継代2（A）に示すように、筋芽細胞は、次に、細長い形状を採用します。 MyoDのは、線維芽細胞に筋芽細胞で発現していないが、<html> （B）。 MyoD陽性細胞の定量化を示します。エラーバーは標準偏差を示します。 n = 3の（B）。筋芽細胞および線維芽細胞の形態（C）との違いを実証する代表画像。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig3.jpg" /> 図3.ヒト一次筋芽細胞は、様々な染色技術を使用して特徴づけることができます。細胞の生存能力は、細胞生存率アッセイのために染色を用いて可視化することができ、増殖のKi67免疫染色を用いて評価することができ、分化は、MF20（ミオシン重鎖）免疫染色および老化を用いて評価することができる老化関連ベータガラクトシダーゼ（SA-βガラクトシダーゼを用いて可視化することができます）染色。<html> ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig4.jpg" /> 図4.ヒト一次筋芽細胞は、in vitroでの筋恒常性の機能的研究のために使用することができます。 A. MF20（ミオシン重鎖）筋管サイズと数にのmiR-378の過剰発現または抑制の効果を示す成人からの差別化の一次筋管の免疫染色。ヒト初代筋芽細胞におけるmiR-378の過剰発現または阻害後のmiR-378およびIGF1R、検証済みのmiR-378標的遺伝子の相対的発現を示すB.定量PCR。 RNU-6およびβ-2ミクログロブリンに対する発現は、それぞれ、示されています。エラーバーはSEMを示します。 N = 3、* - P &lt;0.05、スチューデントT検定。JPG &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

このプロトコルは、成人および高齢者の骨格筋からの単離および筋芽細胞の前駆細胞の培養の、堅牢で再現性と簡単な方法について説明します。ここで使用される筋肉は足と脚の筋肉を含みます。このアプローチは、機能的研究のための一次筋芽細胞の濃縮集団の単離を可能にします。

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

preparation-culture-myogenic-precursor-cellsprimary-myoblasts-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

21.8K ビュー.  University of Liverpool. このプロトコルは、成人および高齢者の骨格筋からの単離および筋芽細胞の前駆細胞の培養の、堅牢で再現性と簡単な方法について説明します。ここで使用される筋肉は足と脚の筋肉を含みます。このアプローチは、機能的研究のための一次筋芽細胞の濃縮集団の単離を可能にします。 

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

発生生物学

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

電気刺激のマウス筋芽細胞前駆細胞およびアプリケーションからの工学骨格筋組織

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

生物工学

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

生物学

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study skeletal muscle reformation and function in a scalable format that is amenable to experimental manipulations. 3D muscle culture systems are desirable as they enable scientists to study skeletal muscle ex vivo in the context of human cells. 3D in vitro&#160;models closely mimic aspects of the native tissue structure of adult skeletal muscle. However, their universal application is limited by the availability of platforms that are simple to fabricate, cost and user-friendly, and yield relatively high quantities of human skeletal muscle tissues. Additionally, since skeletal muscle plays an important functional role that is impaired over time in many disease states, an experimental platform for microtissue studies is most practical when minimally invasive calcium transient and contractile force measurements can be conducted directly within the platform itself. In this protocol, the fabrication of a 96-well platform known as &#39;MyoTACTIC&#39;, and en masse production of 3D human skeletal muscle microtissues (hMMTs) is described. In addition, the methods for a minimally invasive application of electrical stimulation that enables repeated measurements of skeletal muscle force and calcium handling of each microtissue over time are reported.

This manuscript describes a detailed protocol to produce arrays of 3D human skeletal muscle microtissues and minimally invasive downstream in situ assays of function, including contractile force and calcium handling analyses.

ヒト骨格筋微小組織における骨格筋の健康の機能指標の評価

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

医学

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...