Name: identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
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NIAMS 光イメージング セクション顕微鏡と技術的なサポートを提供するために感謝いたします。MF20 Pax7 抗体は、発育の後援の下で開発され、アイオワの大学、生物科学専攻、アイオワ シティで維持発達研究ハイブリドーマの銀行から得られました。この作品は、国立衛生研究所の NIAMS の学内研究プログラムによって支えられました。

このプロトコルではアダルト マウス (2-6 ヶ月)、脛骨前方 (TA) と長趾伸筋 (EDL) の前後肢の筋肉は、SCs の染色蛍光を実行する例として用いられました。マウスおよび筋肉の処理手順をすべて組織解剖は、動物の世話、NIAMS/NIH の使用委員会 (ACUC) によって承認されています。
1. マウスの後肢から TA/EDL 筋を解剖します。
<ol><li>NIH の ACUC のガイドラインの下で CO2充填安楽死室でマウスを安楽死させます。必要な場合は、頚部転位を実行します。</li>
	<li>マウスの顔アップを郭清パッド (仰臥位) に置きます。その腹の皮の上に 70% エタノールをスプレーします。マウスの腹皮の中央に水平方向に開く 1 ~ 2 cm をカットし、マウス フィートに向かって開口部を引っ張って、マウスを deskin します。マウスの後肢の片側を公開します。</li>
	<li>2 つのシャープな鉗子を使用: TA/EDL を付ける、足首の腱を保持するために 1 つを使用し、破るし、TA/EDL を覆う筋膜をせん断する他の 1 つを使用します。筋膜を剥離鉗子の先端の鋭利な TA/EDL 筋の下にあるヒントを実行して、脛骨骨から TA/EDL をデタッチするのに使用します。</li>
	<li>まだそれらを生検鉗子で保持しながら足首の腱をハサミでカットします。足首から膝までの TA/EDL の縦の線に沿ってハサミ鉗子足首側から TA/EDL を持ち上げながら筋肉をトリムします。脛骨から全体の TA/EDL をデタッチする膝側の腱を切った。</li>
</ol>2. TA/EDL 筋の低温埋め込み
<ol><li>液体窒素容器、例えばお風呂の準備します。、液体窒素デュワー フラスコ。Methylbutane を半分に小さなプラスチック ビーカー (約 20 mL) に注ぐ。それを凍結する液体窒素風呂でビーカーを置きます。数分後、methylbutane が固定されることを確認します。 注: 液体窒素、ドライアイスのバケツによって置き換えることができますが、凍結時間は遅くなります。</li>
	<li>小さなプラスチック製のシリンジのプランジャーの平らな表面に切り裂かれた TA/EDL を横たわっていた。数滴の最適な切削温度 (O.C.T.) 化合物 (凍結中) TA/EDL を完全にカバーします。</li>
	<li>液体窒素風呂から methylbutane ビーカーを取るし、温かみのあるオブジェクトで表面を解凍 (e.g。、はさみのハンドル)。すぐにディップ、O.C.T. はプランジャー TA/EDL をスナップ凍結組織を溶かし methylbutane に覆われて。</li>
	<li>鉗子、プランジャーから埋め込まれた組織を外し、1.5 mL 遠心チューブに入れてください。多くのサンプルを処理しながら保存する液体窒素にチューブを配置します。 注: 埋め込み組織は-80 ° C の長期 (2 年) または-20 ° C で短期 (6 ヶ月) に格納できます。</li>
</ol>3. クライオスタット切片
<ol><li>クライオスタットの試料ホルダーの中心に化合物 O.C.T. のドロップを追加します。O.C.T. 化合物はほぼ固化するまでを待ちます。O.C.T. 化合物、足首側に垂直に埋め込まれた TA/EDL をすばやくスティック ダウンと膝側を。</li>
	<li>クライオスタットに試料ホルダーをマウント、10 μ m 間隔で組織をカット、低温セクションに、フロスト コーティング スライドと収集 1 つのスライド上の 4-8 のセクション。</li>
	<li>一夜にして、少なくとも 3 時間室温でセクションを乾燥させます。 注: 乾燥一晩以上冷凍庫のセクションは問題ありませんが、それは必然的に増やすこと、蛍光。最高の結果を得るには、乾燥 0.5 h のセクション進みます固定や染色の手順ですぐに。</li>
	<li>スライド ボックスのスライドを収集し、すぐにそれらを使用または-80 ° C または-20 ° C 保存用のスライドを保存します。</li>
</ol>4. 蛍光染色試薬の調製
<ol><li>
次のバッファーを準備します。
	<ol>
<li>10 x PBS からのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 2 L を準備します。</li>
		<li>16% から 1 × PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 40 mL を準備 PFA。</li>
		<li>PBST の 2 L を準備: 0.1% トリトン-100 と 1 × PBS。</li>
		<li>2% ウシ血清アルブミン (BSA) と pbst; b: PBST の 50 mL を準備します。</li>
		<li>2 %bsa と 5% 通常ヤギ血清 pbst; B-g: PBST の 10 mL を準備します。</li>
		<li>ブロッキング溶液 1 mL を準備します。希釈 AffiniPure Fab フラグメント ヤギ抗マウスは IgG pbst; b (H + L) (1:10)</li>
		<li>200 mL の 1x クエン酸バッファーを準備します。 注: ソリューション上記のボリュームは、少なくとも 5 つのスライドに対して十分です。ボリュームは、スライドの数およびスライド容器のサイズに合わせて調整する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
抗体は汚れるを準備します。
	<ol>
<li>一次抗体 (作業濃度): Pax7 マウスのモノクローナル抗体 (IgG1) を希釈して一次抗体ミックス 1.2 mL を準備 (1 ~ 5 μ g/mL) + ラミニン ポリクローナルウサギ (0.5-2 μ G/ml) MF20 マウスのモノクローナル抗体 (IgG2b) + (0.5 2.5 μ g/mL) pbst; B g 注: MF20 マウスのモノクローナル抗体 (IgG2b) はオプションです。</li>
		<li>二次抗体 (作業濃度): ヤギ抗マウス IgG1 クロス吸着二次抗体、Alexa Fluor 488 希釈することによって二次抗体ミックス 1.2 mL を準備 (0.5-2 μ g/mL) + 二次抗体高いクロス吸着ヤギ抗うさぎ IgG (H + L)、Alexa Fluor プラス 555 (0.5-2 μ g/mL) + ヤギ抗マウス IgG2bクロス吸着二次抗体、Alexa Fluor 647 (0.5-2 μ G/ml) pbst; B g 注: Alexa Fluor 647 はオプションです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 蛍光染色手順
<ol><li>
水分補給、PFA と低温セクションを修正します。
	<ol>
<li>スライド ボックスから TA/EDL クライオ セクション スライドのいくつかを削除します。暖かい室温でスライドを保持トレイにスライド。</li>
		<li>低温 - のすべてのセクション スライドにはが含まれている領域を描画するのに液体ブロッカー ペン (PAP ペン) を使用します。このサークルでは、ソリューションがスライドを離れて流れることをできなくなります。</li>
		<li>研究室の発煙のフードにトレイを取る。4% の 300-500 μ L を追加 10 分 1 × PBS で PFA を洗って室温でセクションを修正する囲まれた領域内のスライドに PFA スライド コンテナーに少なくとも 3 x 5 分。 注意: PFA は毒性と有害廃棄物;ケアと運営し、有害廃棄物容器に廃棄する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
抗原検索
	<ol>
<li>別のスライドのコンテナーを 200 mL のクエン酸バッファーに入力します。</li>
		<li>コンテナーにスライドをコピーします。スライドのコンテナーを 10 分間の高圧モードでスライドを調理する圧力鍋に転送します。</li>
		<li>排水の水で 10 分間転送 PBST (200 mL) を新しいコンテナーにすべてのスライドを持つコンテナーを冷やす、PBST と少なくとも 3 x 5 分用のスライドをすすいでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ブロック
	<ol>
<li>トレイ スライドの乾燥を避けるために湿った環境を作成するスライドを保持する水に浸したキムワイプを追加します。</li>
		<li>トレイにスライドを戻すし、ブロック各スライドに液 200 μ L を追加します。カバー キャップ付きトレイと 30 分間開発ブロックを聞かせてください。 注: マウスの筋肉組織に高いバック グラウンドを作成するマウス IgG の不明確な結合があるので、Pax7 抗体はマウスのモノクローナル抗体です。マウスの非特異的結合をブロック、AffiniPure Fab フラグメント ヤギ抗マウス IgG (H + L) を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
一次抗体を適用します。
	<ol>
<li>スライドのコンテナーに一度 PBST とスライドをすすいでください。その後に移動するスライド染色トレイ。</li>
		<li>各スライド上の一次抗体ミックス 200 μ L を適用、キャップ、トレイをカバーし、反応室温 1 時間または一晩のための 4 ° C で開発を聞かせてください。 注: 4 ° C で一晩反応は満足のいく結果を与えるが室温で反応の開発に最高の結果を与えます。ミオシン MF20 抗体は、トリプル (Pax7、ラミニン、MF20) ラベルを実行するためにミックスに追加できます。MF20 汚れには、筋線維が区別されます。この手順は、二次抗体 (ヤギ抗体) 次の手順でから潜在的な非特異的結合を抑える pbst; B g ブロック一歩としても使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
二次抗体を適用します。
	<ol>
<li>常温 PBST と一次抗体を洗浄、少なくとも 3 x 5 分。</li>
		<li>各スライドに二次抗体ミックス 200 μ L を追加し、少なくとも 1 時間室温で開発する反応します。 注: Pax7 + ラミニン ヤギ抗マウス IgG1 アレクサ 488 とヤギ抗うさぎ Alexa 555 を使用します。 Pax7 + ラミニン + MF20 ミックスでヤギ抗マウス IgG2b Alexa 647 を追加します。</li>
		<li>PBST と二次抗体を洗浄、少なくとも 3 x 5 分。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) カウンターの汚れと取り付け
	<ol>
<li>スライド コンテナーなど、DAPI pbst; 200 mL に 10 μ L の PBST の DAPI (1:20, 000) を希釈します。</li>
		<li>3 分の DAPI コンテナー内のスライドを染色します。</li>
		<li>少なくとも 5 x 5 分 PBST の DAPI を洗い流します。</li>
		<li>メディアをマウントをスライドをマウントします。Coverslips にスライドをカバーします。 注意: DAPI は有害です。取り扱いし、廃棄ボトルで破棄する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 蛍光顕微鏡
注: 上記の報告蛍光汚損のプロトコルと可能にする SCs 可視化ワイド フィールドまたは共焦点蛍光顕微鏡のいずれか。SCs を識別するために最初に困難なことがあります。助けになることがありますいくつかの推奨される手順を示します。
<ol><li>DAPI チャネルと低倍率の目的を使用して、スライドのセクションを視覚化します。</li>
	<li>高から低倍率を切り替えます。SCs を観察するには、少なくとも 20 の X 目的が必要) です。</li>
	<li>488 (FITC) 用デュアル フィルター キューブ/555 SCs を識別するために同時に信号を (ローダミン) Pax7 とラミニンを観察します。この設定は、Pax7 染色の信号はバック グラウンド ノイズに優れたコントラストを持ちます。</li>
	<li>すぐに別の SCs を正しく識別するために DAPI を FITC からチャネル。すべての Sc は、Pax7/DAPI 陽性をする必要があります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle.">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li><li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis.">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li><li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+insect+eye+to+vertebrate+muscle:+redeployment+of+a+regulatory+network.">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li><li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity.">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li><li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential.">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li><li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+the+engines+of+muscle+repair.">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li><li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration:+therapeutic+potential+and+roadblocks.">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li><li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis.">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li><li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration:+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes.">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation.">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li><li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li><li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence:+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts.">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li><li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements.">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

上記のプロトコルは、ゼブラフィッシュ骨格筋12Pax7/MF20 染色法に基づいていた。ソリューションの使用手順をブロックが同じまたは類似しました。使用抗体は同一です。調整手順は、マウスの筋肉組織と SCs の機能に基づいていた。まず、ラミニン抗体は、視覚化し、SCs の位置を確認するためにミックスに追加されました。それは 488/555; のデュアル フィルター キューブを?...

骨格筋は多核巨細胞の筋肉細胞から成るであると呼ばれる、力および収縮運動を生成する筋線維で構成されています。いくつかの顔面の筋肉を除いて、最も骨格筋は、体節1と呼ばれる一時的な萌芽期の構造から派生します。筋芽細胞になる上皮体節から筋前駆細胞が剥離されます。さらに筋芽細胞は多核筋線維を形成する細胞になる融合細胞に分化します。上記のプロセス筋形成と遺伝子発現の制御を一時的に規制されているが特徴です。筋原性前駆体は筋芽細胞表現 MyoD および/または Myf5 と心筋細胞表現する myogenin とミオシンの2,3に対し Pax3 と Pax7 を表現します。筋肉の成長は、既存のファイバー (過形成) により筋核を組み込むことによって、筋線維 (肥大) のサイズ4の増加によってに筋線維が大きくなるプロセスです。筋肉の成長の間に、彼らは区別し、自己更新できる幹細胞プロパティを持つ筋細胞の持続可能なソースです。これらの細胞は筋鞘 (筋線維の細胞膜) と基底膜5の間の物理的な場所に基づく衛星細胞と呼ばれます。SCs は、精力的に幼若期 (生後マウスの最初の 2-3 週間) 筋肉の成長に貢献するが、大人の筋6を安静時の休止状態になります。驚くことに、筋肉への応答で再アクティブ化できます傷つけるし、7損傷した筋肉を修復する新しい筋肉細胞に分化します。
茎セルのプロパティは、基本的な筋生物学、筋疾患8の治療に関連する SCs の研究を行います。その結果、過去数十年で強烈な調査の領域だった。途方もない進歩は、遺伝学および SCs9,10のエピジェネティクスを切り裂くことにしました。分離するとその場でSCs を識別する技術を開発し、11の方法に沿って最適化します。免疫蛍光染色は、Pax7 を含む特定の抗体を使用して SCs を識別できます。しかし、希少性と大人の骨格筋組織の強い自己蛍光と組み合わせて SCs の小型レンダリング視覚化挑戦。ここでは、蛍光染色プロトコル Pax7 のマウスの筋肉組織の最適化し、ゼブラフィッシュ筋12既存法に基づくについて述べる。さらに、SCs が下である基底膜を識別するために異なる蛍光ラベルの付いたラミニン抗体を採用します。このプロトコルは、一貫して Pax7 正 SCs と発達段階とすべてのテストの生理学的な条件の下で筋前駆体の可視化をできます。

<table><tbody><tr><td>methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62550-01</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco, Themo Fisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>TED PELLA</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>0 1-6201</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>20x Citrate Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>00 500</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td><td>Developmental Study Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Laminin polyclonal rabbit antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2&lt;sub&gt;b&lt;/sub&gt;) (supernatant)</td><td>Developmental Study Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG2&lt;sub&gt;b&lt;/sub&gt; cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1860 cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR wide-field fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 confocal microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM780 confocal microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuisinart electronic pressure cooker</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies

蛍光抗体法は、異なる細胞ティッシュ セクションの種類を識別するため効果的な方法です。目的のセル人口を研究するために特定のセル マーカーの抗体はティッシュ セクションに適用されます。大人の骨格筋衛星細胞 (SCs)、筋肉の修復と再生に貢献する幹細胞です。したがって、視覚化し、異なる生理学的な条件の下で衛星細胞集団を追跡することが重要です。安静時骨格筋の SCs は基底膜と筋線維膜の間に存在します。筋線維、細胞培養、SCs を識別するために一般的に使用されるマーカーは、ペアになっているボックス タンパク質 Pax7 です。この記事では、非特定の染色と背景を最小限に抑える骨格筋のセクションに最適化された Pax7 蛍光プロトコルが表示されます。基底膜のタンパク質 (ラミニン) を認識する別の抗体はまた SCs 同じようなプロトコルを識別するのに役立つダブルまたはトリプル Pax7 興味の他の蛋白質のための抗体とラベル付けを実行するも使用ことができますを追加しました。

上記の手順に従って、SCs は、蛍光顕微鏡 (図 1) 成人の安静時筋セクションで正常に視覚化できます。大人の筋組織は強い自己蛍光が繊維の特定のタイプで、明るいアレクサ シリーズ染料がバック グラウンド ノイズを克服できるし、際立っている信号 (図 1 a, B; 矢印)。二光子励起共焦点顕微鏡は、広視野蛍光?...

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Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

衛星細胞の正確な同定は様々 な生理学的、病理学的条件の下でその機能を研究するために不可欠です。この記事では、蛍光抗体法による染色による大人の骨格筋のセクションの衛星細胞を識別するためにプロトコルを示します。

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

発生生物学

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

ラットヘッドBranchiomeric筋肉から衛星細胞の単離とキャラクタリゼーション

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

カーディオトキシン損傷による骨格筋再生中の衛星細胞機能の解析と生体内での自己送出型siRNAの注射

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

遺伝学

マウス四肢筋からのサテライト細胞単離とフローサイトメトリー解析

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

著者スポットライト:マウス筋幹細胞におけるCistrome解析 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&amp;RUN解析のための効率的なプロトコール

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

生物学

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

要約

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ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

ラットヘッドBranchiomeric筋肉から衛星細胞の単離とキャラクタリゼーション

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

カーディオトキシン損傷による骨格筋再生中の衛星細胞機能の解析と生体内での自己送出型siRNAの注射

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&RUN解析のための効率的なプロトコール

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&RUN解析のための効率的なプロトコール

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&RUN解析のための効率的なプロトコール

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製