ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

我々は、脆弱なゼブラフィッシュ胚の無制限の成長を可能にし、同時に完全に固定された位置にそれらを維持するタイムラプスイメージングのための取り付け方法を開発しました。この取り付け方法は、高速、簡単、安価であり、それは任意の逆顕微鏡上のラボイメージングのために働きます。我々は、生きているゼブラフィッシュ胚のイメージングのためのこの方法を開発したが、それは他の小さな水生動物モデルのイメージングのために変更することができる。

まずは、成虫のゼブラフィッシュを繁殖させることから始めます。午後には、魚を1対2の雄と雌の比率で繁殖タンクに入れる。次に、胚培地中に1%低溶融アガロースのストック溶液を調製し、電子レンジで加熱して溶解する。

アガロース溶液を1.5ミリリットルチューブにアリコートする。蒸留水で4%トリケーヌのストック溶液を作り、アガロースとトリケーヌを摂氏4度で貯蔵します。トリケーヌは有毒であり、計量し、ヒュームフードで準備する必要があります。

交配後、ペトリ皿でE3のゼブラフィッシュ胚を収穫し、取り付ける前に約28時間摂氏26.5度でインキュベートします。0.02%トリカインで胚を麻酔し、コリオンを優しくつかんで引き離して胚を放出させることで顕微鏡下でデコールニオンする。取り付ける直前に、アガロース溶液を摂氏65度に加熱し、胚が熱によって害を受けないように約30°Cに冷却し、アガロース溶液にトリカインを加えます。

カバーグラス底面がゼロの35ミリメートルガラス底皿を使用してください。ガラスピペットまたはマイクロピペットで皿の底に向かって側面の1つを持つデコリオネート胚をそっと置き、残りのE3をマイクロピペットで慎重に取り除きます。最初のアガロース溶液を皿の底に取り付けられたカバーグラスによって作成された小さな井戸に加えて、アガロースが小さな井戸を覆うがオーバーフローしないことを確認するために胚を覆う。

カバーグラスで小さな井戸を覆い、2つのカバーグラスの間に胚を持つ狭いアガロースで満たされた空間を作成します。カバーグラスの上に1%アガロース溶液の層を置き、カバーグラスを固めるのと同じ位置に保ちます。その後、皿の残りの部分を0.02%トリカインを含むE3で満たし、システムを水分補給します。

層1の最適なアガロース濃度を同定するには、アガロースの濃度を増加させるに胚を取り付け、タイムラプスイメージングを行い、胚の歪みおよび運動性を最小限に抑える濃度を同定し、その結果に基づいてより細かい濃度範囲を試験する。このプロトコルの最も重要なステップは、層1に対するアガロースの最適濃度を特定することです。0.030%0.032%など、異なるナノ濃度のアガロースをテストします。

最適な濃度を見つけるために。胚のタイムラプスイメージングを行うために、インキュベーターを摂氏28.5度に設定した顕微鏡ステージを使用し、最大55時間画像を使用します。同時に複数の胚を画像化するには、いくつかの皿を保持し、胚が水平に配置されるように皿を1つずつ回転させるステージアダプタを使用します。

低倍率の目的を選択し、接眼レンズを使用して胚を見つけ、最後に皿を回転させることによって水平に整列させる。ソフトウェアで胚の位置を記録し、データを自動保存するためのファイル名を作成します。ピンホールのサイズ、スキャン速度、画像サイズ、ズームを設定します。

次に、画像と蛍光チャネルを撮影するための高倍率を選択します。各チャンネルに対して、レーザーパワーと検出器の高電圧を調整し、飽和を避け、写真の漂白を制限しながら、可能な限り最高のダイナミックレンジを収集するようにしてください。次に、10Xの目的で胚全体を画像化するには、ソフトウェア内の大きな画像キャプチャ設定を設定して、いくつかの視野を画像化し、胚の位置を調整して、この大きな画像領域内に収まることを確認します。

原稿の指示に従って Z スタックをキャプチャするための設定を行います。長期のタイムラプスイメージング中に複数の胚の焦点を維持するために、自動フォーカスを使用し、各胚の個々のオフセットレベルを調整して参照面に焦点を当てます。その後、顕微鏡ソフトウェアにタイムラプスパラメータを設定し、1時間間隔で55時間の画像を作成します。

各サイクルで、2 つの胚データセットを順番にキャプチャし、データを自動的に保存します。顕微鏡ソフトウェアを使用して画像を処理します。複数の胚が画像化された場合は、イメージングの場所に基づいてデータセットを分割して、各胚に対して独立したファイルを作成します。

最大強度投影または同様のツールを使用して、3D 時間データセットを 2D 時間データセットに変換します。最後に、AVI として保存し、再生速度が毎秒 5 フレームの場合は 200 ミリ秒間隔の圧縮なしオプションを選択して、ムービーファイルを作成します。この層状取り付け方法は、ゼブラフィッシュ胚を成長させながら、同じ動きを制限しながらイメージングすることを可能にする。

アガロース濃度が高すぎると、胚が歪んでしまいます。しかし、それが低すぎると、タイムラプス顕微鏡の間に視野から移動します。最適なアガロース濃度は、胚全体のRFPを発現する0.028〜0.034%の生きたトランスジェラフィッシュと血管構造の内皮細胞中のGFPの間で55時間イメージングされ、その間に間皮間血管が発芽し、腸管および頭部血管凝縮が発症し、尾頭静脈叢が拡張して発生することが判明した。

GFPおよび運動ニューロンを発現する胚を、運動ニューロンの発達を視覚化するために画像化した。運動ニューロン軸索は、腹側神経管から、胚の腹側に向かって、スマイトの上に芽を出す。セグメント間血管の位置に関連した運動ニューロン軸索の背部発芽の共発達は、より高い倍率を用いて画像化された。

これにより、神経管から発芽する側腹軸索と裏軸索の細かい細部を可視化することが可能になりました。スマイト数が増加するにつれて、スマイトの長さと幅も広がります。このプロセスは、筋肉中のGFPを発現するトランスジェニック胚を用いて画像化した。

アガロースの最適濃度は非常に狭いため、アガロースのストック溶液を調製する際の測定の小さな変動に非常に敏感であり、アガロース溶液の新しいバッチごとに再定義する必要があります。画像のサイズと解像度、スキャン速度、ズーム、高電圧検出器、レーザーパワーなどのイメージングパラメータを慎重に設定して、実験間の一貫性を確保し、長期間のタイムラプスイメージング中に光毒性や光の漂白の可能性を低減することが重要です。この遺伝子導入ゼブラフィッシュ胚に対するこの取り付け方法を用いて、生物全体の拡張タイムラプスイメージングを行い、異なる組織がどのように一緒に発達するかを視覚化することができます。