Desenvolvemos um método de montagem para imagens de lapso de tempo que permite o crescimento irrestrito de embriões frágeis de zebrafish e, ao mesmo tempo, os mantém em uma posição completamente fixa. Este método de montagem é rápido, fácil e barato e funciona para imagens de laboratório em qualquer microscópio invertido. Desenvolvemos este método para a imagem de embriões de zebrafish vivos, mas ele poderia ser modificado para imagens de outros pequenos modelos de animais aquáticos.
Comece criando o zebrafish adulto. À tarde, coloque os peixes em tanques de reprodução em uma proporção macho-fêmea de um para dois. Em seguida, prepare uma solução de estoque de 1% de derretimento baixo agarose em mídia de embrião e dissolvê-lo aquecendo-o em um forno de micro-ondas.
Aliquot a solução agarose em tubos de 1,5 mililitro. Faça uma solução de estoque de 4% de tricaine em água destilada e armazene a ágarose e tricaine a quatro graus Celsius. Tricaine é tóxico e tem que ser pesado e preparado em um capô de fumaça.
Após o acasalamento, colmeia os embriões de zebrafish em E3 em uma placa de Petri e incuba-os a 26,5 graus Celsius por cerca de 28 horas antes da montagem. Anestesiar os embriões com 0,02% de tricaine e descorriosá-los sob um microscópio, agarrando suavemente e puxando o acorde para liberar o embrião. Pouco antes da montagem, aqueça a solução agarose a 65 graus Celsius e deixe esfriar a aproximadamente 30 graus Celsius para que o embrião não seja prejudicado pelo calor e adicione tricaine à solução agarose.
Use pratos de fundo de vidro de 35 milímetros com um fundo de vidro de cobertura número zero. Coloque suavemente um embrião descorioado com um de seus lados laterais em direção ao fundo do prato com uma pipeta de vidro ou uma micropipette, em seguida, remova cuidadosamente qualquer E3 restante com uma micropipette. Adicione a primeira solução agarose ao pequeno poço criado pela tampa presa na parte inferior do prato para cobrir o embrião certificando-se de que a agarose cobre o poço pequeno, mas não transborda.
Cubra o pequeno poço com um óculos de cobertura para criar um espaço estreito cheio de agarose com o embrião entre os dois óculos de cobertura. Coloque uma camada de solução de 1%agarose em cima da tampa por toda a parte inferior do prato que manterá a tampa no lugar à medida que se solidificar. Em seguida, encha a porção restante do prato com E3 contendo 0,02% de tricaine para manter o sistema hidratado.
Para identificar a concentração ideal de agarose para a camada um, monte os embriões em concentrações crescentes de agarose e realize imagens de lapso de tempo para identificar a concentração que minimiza a distorção e a motilidade do embrião, em seguida, teste uma gama mais fina de concentrações com base nos resultados. O passo mais crítico deste protocolo é identificar a concentração ideal de agarose para a camada um. Teste diferentes nano concentrações de agarose, como 0,030%0,032%etc.
para encontrar a concentração ideal. Para realizar imagens de lapso de tempo dos embriões, use um estágio de microscópio com uma incubadora fixada a 28,5 graus Celsius e imagem por até 55 horas. Para imagem simultânea de vários embriões, use um adaptador de palco que contém vários pratos e gire os pratos um a um para que os embriões estejam posicionados horizontalmente.
Selecione um objetivo de baixa ampliação, localize os embriões usando a ocular e, finalmente, alinhe-os horizontalmente girando os pratos. Registo a localização dos embriões no software e crie um nome de arquivo para autossusuer os dados. Defina o tamanho do pinhole, a velocidade de digitalização, o tamanho da imagem e o zoom.
Em seguida, selecione uma ampliação maior para capturar imagens e os canais de fluorescência a serem imagens. Para cada canal, ajuste a potência do laser e o detector de alta tensão certificando-se de coletar o melhor alcance dinâmico possível, evitando a saturação e limitando o branqueamento fotográfico. Em seguida, para imaginar todo o embrião com um objetivo de 10X, defina as grandes configurações de captura de imagem no software para visualizar vários campos de visão e costurá-los juntos ajustando a posição do embrião para garantir que ele se encaixe dentro desta grande área de imagem.
Configure as configurações para capturar pilhas Z de acordo com as instruções do manuscrito. A fim de manter o foco de múltiplos embriões durante a imagem de lapso de tempo de longo prazo, use um foco automatizado e ajuste os níveis de deslocamento individuais para cada embrião se concentrar no plano de referência. Em seguida, configure parâmetros de lapso de tempo no software de microscópio para imagem por uma duração de 55 horas em intervalos de uma hora.
Em cada ciclo, capture dois conjuntos de dados de embriões sequencialmente e salve os dados automaticamente. Use o software de microscópio para processar as imagens. Se mais de um embrião for visualizado, crie arquivos independentes para cada embrião dividindo os conjuntos de dados com base na localização da imagem.
Converta os conjuntos de dados de tempo 3D em conjuntos de dados de tempo 2D usando projeções de intensidade máxima ou uma ferramenta semelhante. Finalmente, crie arquivos de filme salvando como AVI e selecionando a opção sem compactação com intervalos de 200 milissegundos para uma velocidade de reprodução de cinco quadros por segundo. Este método de montagem em camadas torna possível a imagem de embriões de zebrafish, permitindo que eles cresçam, mas ao mesmo tempo restringindo seu movimento.
Se a concentração de ágarose é muito alta, os embriões ficam distorcidos. Mas se for muito baixo, eles sairão do campo de visão durante a microscopia de lapso de tempo. A concentração de agarose ideal foi encontrada entre 0,028 e 0,034%Os zebrafish transgênicos vivos expressando RFP em todo o embrião e GFP nas células endoteliais da vasculatura foram imagens durante 55 horas durante as quais o vaso intersegemental brotou, a vasculatura subintestinal e a cabeça se desenvolveu, e a condensação de plexidade da veia caudal com a extensão do tronco ocorreu.
Embriões que expressam GFP e neurônios motores foram imagens para visualizar o desenvolvimento do neurônio motor. Os axônios do neurônio motor brotam do tubo neural ventral sobre os somites em direção ao lado ventral do embrião. O co-desenvolvimento do broto dorsal dos axônios do neurônio motor em relação à posição dos vasos intersegmentais foi imageado utilizando-se uma ampliação mais elevada.
Isso possibilitou visualizar os detalhes mais finos do axônio ventral brotando, bem como o axônio dorsal brotando do tubo neural. À medida que o número de somitas aumentava, as somitas também se estendem em comprimento e largura. Este processo foi imageado usando embriões transgênicos expressando GFP nos músculos.
Como a concentração ideal de agarose é muito estreita, é muito sensível a pequenas variações nas medições ao preparar a solução de estoque de agarose e precisa ser redefinida para cada novo lote de solução agarose. É importante definir cuidadosamente os parâmetros de imagem, incluindo tamanho e resolução de imagem, velocidade de varredura, zoom, alta tensão do detector e poder laser para garantir a consistência entre os experimentos e também reduzir a possibilidade de toxicidade fotográfica e branqueamento de fotos durante imagens de longo prazo. Usando este método de montagem para embriões transgênicos de zebrafish seguido de imagens estendidas de lapso de tempo de todo o organismo, podemos visualizar como diferentes tecidos se desenvolvem juntos.
